属中的表达描述于例如 美国专利6,022,725中。对于曲霉属菌种的转化，还参考Cao等人（2000) Science 9 :991-1001。用载体系统构建遗传上稳定的转化体，凭借所述载体系统编码酶的核酸被稳定整合 进宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术选择和纯化转化体。
[0214] 制备用于转化的木霉属（Trichoderma sp.)例如可设及从真菌菌丝制备原生质 体。参见Campbel 1等人（1989)Curr. Genet. 16: 53-56。菌丝可购自萌发的植物性芽抱。菌丝 经煮解细胞壁的酶处理，得到原生质体。原生质体通过在悬浮培养基中存在渗透稳定剂得 W保护。运些稳定剂包括山梨醇、甘露糖醇、氯化钟、硫酸儀等等。通常运些稳定剂的浓度在 0.8M和1.2M之间变化，例如，1.2M山梨醇溶液可用于悬浮培养基中。
[021日]将DNA摄取到宿主木霉ji(Trichoderma SP.)菌株中取决于巧离子浓度。一般来 讲，约IO-SOmM之间的化C12用于摄取溶液中。另外的合适化合物包括缓冲系统，诸如TE缓冲 液（IOmM lYis、pH 7.4; ImM抓TA)或IOmM MOPS,pH 6.0和聚乙二醇。据信聚乙二醇融合细 胞膜，因此允许培养基的内容物递送到木霉属(Trichoderma sp.)菌株的细胞质中。此类融 合在很多情况下得到整合进宿主染色体中的质粒DNA的多个拷贝。
[0216] 通常木霉ji(Trichoderma sp.)的转化使用通常在1〇5至lOV血，尤其2X10%L的 密度下的原生质体或经过渗透性处理的细胞，可将10化L体积的含运些原生质体或细胞的 适当溶液(例如，1.2M山梨醇和50mM化Cl2)与期望的DNA混合。一般来讲，将高浓度的PEG添 加到摄取溶液中。可将0.1体积至1体积的25%PEG 4000添加到原生质体悬浮液中；然而，将 约0.25体积添加至原生质体悬浮液中是可用的。还可将添加剂诸如二甲基亚讽、肝素、亚精 胺、氯化钟等等添加到摄取溶液中W有利于转化。类似的程序可用于其它真菌宿主细胞。参 见例如，美国专利6,022,725。
[0217] 3.3.表达
[0218] 产生酶的方法可包括在有利于产生酶的条件下培养如上所述的宿主细胞并且从 细胞和/或培养基中回收酶。
[0219] 用于培养细胞的培养基可W是适合于生长所考虑的宿主细胞和获得酶的表达的 任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可购自商业供应商或可根据公布的配方(例 如，如美国典型培养物保藏中屯、（American Type CulUire Collection)的目录中所述）进 行制备。
[0220] 从宿主细胞分泌的酶可用于全肉汤制备。在本发明的方法中，制备重组微生物的 耗尽全发酵肉汤可使用本领域中已知的任何培养方法来实现，得到酶的表达。发酵可因此 理解为包括在合适的培养基中和在允许酶表达或分离的条件下进行在实验室或工业发酵 中的摇瓶培养、小规模发酵或大规模发酵(包括连续式、分批、分批补料或固态发酵）。术语 "耗尽全发酵肉汤"在本文定义为包括培养基、细胞外蛋白质（例如，酶)和细胞生物质的发 酵材料的未分级的内容物。应当理解，术语"耗尽全发酵肉汤"还涵盖使用本领域中熟知的 方法裂解或透化的细胞生物质。
[0221] 从宿主细胞分泌的酶可便利地通过熟知程序从培养基回收，包括通过离屯、或过滤 从培养基分离细胞，W及借助于盐诸如硫酸锭沉淀出培养基的蛋白质性组分，然后使用色 谱程序诸如离子交换色谱法、亲和色谱法等。
[0222] 在载体中编码酶的多核巧酸能够可操作地连接至控制序列，控制序列能够提供宿 主细胞对编码序列的表达，即载体是表达载体。控制序列可例如通过添加另外的转录调控 元件来修饰，W使控制序列指导的转录的水平更响应于转录调节子。控制序列可尤其包含 启动子。
[0223] 宿主细胞可在允许酶表达的合适的条件下培养。酶的表达可为组成型的，使得它 们可连续地产生，或可为诱导型的，运需要刺激来引发表达。就诱导型表达而言，蛋白质产 生可在需要时通过例如将诱导剂物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖，添加到培养基中来引 发。多肤还可在体外无细胞系统诸如TNT?(Promega)兔网织红细胞系统中重组地产生。
[0224] 表达宿主还可在有氧条件下在适当的宿主培养基中培养。根据宿主的需要和期望 酶的产生，可提供揽拌和透气的组合或摇动，其中产生在适于该宿主的溫度下发生，例如约 25°C至约75°C(例如，30°C至45°C)。培养可发生约12小时至约100小时或更长时间及它 们之间的任何小时值，例如24小时至72小时）。通常，同样根据关于产生酶的宿主所需的培 养条件，培养肉汤的pH为约4.0至约8.0。 帷引 3.4.酶活性的鉴定
[0226]为了评估酶在宿主细胞中的表达，测定可测量表达的蛋白质、对应的mRNA或酶活 性。例如，合适的测定包括RNA印迹、逆转录酶聚合酶链反应和原位杂交，杂交使用适当的标 记杂交探针。合适的测定还包括例如通过直接测量培养基中的产物的测定来测量样品中的 酶活性。例如，葡萄糖浓度可使用葡萄糖试剂试剂盒15-UV号(Sigma化emical公司）或仪器 诸如Technicon自动分析仪来测定。a-淀粉酶活性还可通过任何已知的方法来测量，诸如 PAHBAH或ABTS测定。海藻糖酶活性可如实施例节中所述进行测量。测定还在本领域中已知 测量其它酶活性。 帷7] 3.5.用于富集和纯化本发明的酶的方法
[0228] 发酵、分离和浓缩技术是本领域中熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的含 有酶多肤的溶液。
[0229] 在发酵之后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮固体， 包括残余的粗发酵材料，获得酶溶液。一般使用过滤、离屯、、微量过滤、旋转真空转筒过滤、 超滤、离屯、之后进行超滤、提取或色谱法等。
[0230] 希望使含有酶多肤的溶液浓缩W优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加的溫育时 间W收集富集的或纯化的酶多肤。
[0231] 含有酶的溶液使用常规浓缩技术来浓缩，直到获得期望的酶水平。浓缩含有酶的 溶液可通过本文讨论的任何技术来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空 过滤和/或超滤。
[0232] 将酶溶液浓缩成浓缩的酶溶液，直到浓缩的含有酶多肤的溶液的酶活性处于期望 的水平。
[0233] 在发酵期间，酶多肤积聚在培养肉汤中。对于期望酶的分离、富集或纯化，培养肉 汤经过离屯、或过滤W消除细胞，并且所得无细胞液体用于酶富集或纯化。在一个实施方案 中，使用硫酸锭，使无细胞肉汤在约70%饱和度下经历盐析;然后将70%饱和度-沉淀部分 溶解于缓冲液中并且施加至柱诸如S邱hadex G-IOO柱，并且洗脱W回收酶活性部分。对于 另外的富集或纯化，可使用常规过程诸如离子交换或亲和力色谱法。
[0234] 对于产生规模回收，酶多肤可一般如上所述通过经由用聚合物絮凝除去细胞来富 集或部分纯化。另选地，酶可通过微量过滤之后进行通过使用可用的膜和设备来超滤的浓 缩来富集或纯化。然而，对于一些应用，酶不必富集或纯化，并且全肉汤培养物可裂解且使 用，而不需另外的处理。酶可然后被处理成例如颗粒料。
[0端]4.海藻糖酶的组合物和用途
[0236] 本发明的海藻糖酶可用于多种工业应用。例如，海藻糖酶可用于淀粉酶转化过程， 尤其是发生液化的淀粉的糖化和发酵过程。期望的最终产物可W是可通过淀粉底物的酶转 化所产生的任何产物。例如，期望产物可为富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，其可用于其它过 程，诸如制备HFCS，或可转化成多种其它有用的产物，诸如抗坏血酸中间体(例如，葡萄糖酸 盐；2-酬基-k古洛糖酸；5-酬基-葡萄糖酸盐;和2，5-二酬基葡萄糖酸盐）；1，3-丙二醇；芳 族氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸和色氨酸）；有机酸(例如，乳酸、丙酬酸、班巧酸、异巧 樣酸、葡萄糖酸和草酷乙酸）；氨基酸(例如，丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸）；抗生素;抗 微生物剂;酶;维生素;和激素。
[0237] 淀粉转化过程可为设计来产生用于燃料或饮用（即，可饮醇）的醇的前体至（或同 时)发酵过程。本领域的技术人员了解可用于产生运些最终产物的各种发酵条件。海藻糖酶 还可用于食品制备的组合物和方法。W下更详细地描述海藻糖酶的运些各种用途。
[0淵]4.1.淀粉底物的制备
[0239]本领域的技术人员了解可用于制备用于本文公开的过程中的淀粉底物的可用方 法。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷物或全粒。更具体地，颗粒状的淀粉 可获自玉米、玉米棒、小麦、大麦、裸麦、黑小麦、蜀泰、西米、粟、树馨、木馨、高梁、稻、魏豆、 香蕉或马铃馨。玉米含有约60 %-68%的淀粉；大麦含有约55%-65%的淀粉；粟含有约 75 % -80 %的淀粉;小麦含有约60 % -65 %的淀粉;并且精米含有70 % -72 %的淀粉。具体地 说，设想的淀粉底物为玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可为娠磨淀粉或全淀粉并且 包括玉米固体，诸如玉米种仁、玉米教皮和/或玉米棒。淀粉还可为高度精炼的生淀粉或淀 粉精炼过程的原料。各种淀粉还为可商购获得的。例如，玉米淀粉购自Cerestar、Sigma和 Katayama Qiemical Industiy公司（Japan);小麦淀粉购自Sigma;甘馨淀粉购自Wako化re Chemical Industry 公司（Japan);并且马铃馨淀粉购自 Nakaari Chemical Ph曰rm曰ceutic曰讼司（Jap曰n) C
[0240] 淀粉底物可为来自研磨全粒的粗制淀粉，其含有非淀粉部分，例如胚芽残余物和 纤维。研磨可包括湿式研磨或干式研磨或娠磨。在湿式研磨中，全粒浸泡在水或稀酸中W将 谷粒分离成它的组分部分，例如，淀粉、蛋白质、胚芽、油、种仁纤维。湿式研磨有效地分离胚 芽和粗粉(即，淀粉颗粒料和蛋白质)并且尤其适用于生产糖浆。在干式研磨或娠磨中，全种 仁被娠磨成细粉并且常常被处理而无需将谷粒分成它的组分部分。在一些情况下，回收来 自种仁的油。干式娠磨的谷粒因此将包含除淀粉之外显著量的非淀粉碳水化合物复合物。 干式娠磨淀粉底物可用于生成乙醇和其它生物化学品。待处理的淀粉可具有高度精炼的淀 粉质量，例如至少90%、至少95%、至少97%或至少99.5%纯。
[0241] 4.2.淀粉的糊化和液化
[0242] 如本文所用，术语"液化Qiquefaction或liquefy)"是指淀粉转化成较不粘稠且 较短链的糊精的过程。一般来讲，此过程设及淀粉的糊化同时或之后添加O-淀粉酶，尽管任 选地可添加另外的液化诱导酶。在一些实施方案中，如上所述制备的淀粉底物用水制浆。淀 粉浆液可含有W干固体的重量百分比的形式约10 %-55 %、约20 % -45 %、约30 % -45 %、约 30 %-40 %或约30 %-35 %的淀粉。可用例如计量累将a-淀粉酶化C 3.2.1.1)添加到浆液 中。通常用于此应用的O-淀粉酶为热稳定的细菌O-淀粉酶，诸如嗜热脂肪芽抱杆菌O-淀粉 酶。O-淀粉酶通常例如W约1500个单位每千克淀粉干物质供应。为了优化a-淀粉酶稳定性 和活性，通常将浆液的pH调节至约抑5.5-6.5并且还添加约ImMl丐(约40ppm游离的巧离子）。 嗜热脂肪芽抱杆菌变体或其它海藻糖酶可需要不同的条件。在液化之后剩余在浆液中的细 菌Ct-淀粉酶可通过多种方法失活，包括降低后续的反应步骤中的抑或在酶是依赖于巧的情 况下通过除去浆液中的巧。
[0243] 淀粉加上a-淀粉酶的浆液可连续累送通过蒸汽加热至l〇5°C的喷射蒸煮器。糊化 在运些条件下快速发生，并且结合有显著的剪切力，酶活性使淀粉底物开始水解。在喷射蒸 煮器中的停留时间是短暂的。部分糊化的淀粉可穿过一系列保持在l〇5°C-ll(TC下的保持 管中并且保持5min-8minW完成糊化过程r初级液化"）。水解成需要的DE是在85°C-95°C或 更高溫度下在保持槽中约1小时至2小时来完成（"二级液化"）。运些槽可含有导流板W阻止 返混。如本文所用，术语"二级液化的分钟"是指从二级液化开始到测量右旋糖当量(DE)的 时间所流逝的时间。然后使浆液冷却至室溫。此冷却步骤可为30分钟至180分钟，或更长时 间。液化淀粉通常呈具有约10 % -50 % ;约10 %-45 % ;约15 % -40 % ;约20 %-40 % ;约25 % -40%;或约25%-35%的干固体含量(w/w)的浆液的形式。
[0244] 在具体实施方案中，出于生产高纯度葡萄糖糖浆、HFCS、麦芽糖糊精等的目的，淀 粉液化是在90°C-115°C的溫度范围下进行。
[0245] 4.3.糖化
[0246] 使用a-淀粉酶，任选地在其它酶的存在下，液化淀粉可糖化成富含低DP(例如，DPl +DP2)糖类的糖浆。糖化产物的确切组分取决于使用的酶的组合，W及处理的颗粒状淀粉的 类型。有利地，使用提供的海藻糖酶可获得的糖浆可含有糖化淀粉中总低聚糖的超过30%， 例如45%-65%或55%-65%的重量百分比的DP2。糖化淀粉中（DP1+DP2)的重量百分比可超 过约70%，例如，75%-85%或80%-85%。淀粉酶还产生在糖浆产物中相对高收率的葡萄 糖，例如DP1〉20%。
[0247] 尽管液化通常W连续过程的形式进行，但是糖化常常W分批过程进行。糖化通常 在约60°C-65°C的溫度和约4.0-4.5的抑，例如抑4.3下最有效，运需要冷却液化淀粉且调 节液化淀粉的pH。糖化可例如在介于约40°C、约50°C或约55°C至约60°C或约65°C之间的溫 度下进行。糖化通常在揽拌槽中进行，其可能需要数小时来填满或清空。酶通常在槽填满时 W固定比率添加到干燥的固体中，或在填充阶段开始时W单剂量的形式添加。制备糖浆的 糖化反应通常在约24-72小时，例如24-48小时内进行。当达到最大DE或期望DE时，反应通过 例如加热至85°C持续5min来停止。进一步溫育将导致较低的DE，最终至约90DE，因为积聚的 葡萄糖通过酶逆反应和/或利用热力学平衡的途径再聚合成异麦芽糖/或其它逆产物。当使 用淀粉酶时，糖化最佳是在约30°C至约75°C，例如45°C-75°C或47°C-74°C的溫度范围下进 行。糖化可在约pH3至约pH7，例如抑3.0-pH7.5、pH3.5-pH5.5、pH3.5、pH3.8或pH 4.5的抑范围内进行。
[0248] 淀粉酶可W组合物的形式添加到浆液中。淀粉酶可W约0.6-lOppm ds，例如化pm ds的量添加到颗粒状淀粉底物的浆液中。淀粉酶可W全肉汤、澄清酶、富集酶、部分纯化酶 或纯化酶的形式添加。例如用PA皿AH测定来测量，淀粉酶的比活性可为约300U/mg的酶。淀 粉酶还可W全发肉汤产物的形式添加。
[0249] 淀粉酶可W分离的酶溶液的形式添加到浆液中。例如，淀粉酶可W由表达