[01841
[0185] 在一些实施方案中，本发明的酶包括一个或多个氨基酸残基的缺失、置换、插入或 添加。在一些实施方案中，本发明的酶来源于亲本酶通过一个或数个氨基酸残基的保守置 换得到的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的酶来源于亲本酶通过一个或多个氨基 酸残基的缺失、置换、插入或添加得到的氨基酸序列。在所有情况下，表达"一个或多个氨基 酸残基"是指10个或更少，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基。
[0186] 在一些实施方案中，本发明的酶由核酸编码，该核酸在严格条件下杂交至与编码 本发明的酶的核酸互补的核酸序列。
[0187] 本发明的酶可W是"前体"酶、"未成熟"酶或"全长"酶，在运些情况下它们可包含 信号序列，或可W是"成熟"酶，在运种情况下它们可不含信号序列。多肤的成熟形式一般是 最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号是指相应多肤的成熟形式。本发 明的酶多肤还可经过截短W除去N末端或C末端，只要所得的多肤保留酶活性即可。
[0188] 本发明的酶可W是"嵌合"或"杂交"多肤，因为它包括第一酶多肤的至少一部分和 第二酶多肤的至少一部分(此类嵌合酶最近被"重新发现"为结构域交换酶）。本发明的酶可 还包含异源信号序列或表位例如W允许跟踪或纯化。示例性异源信号序列来自地衣芽抱杆 菌淀粉酶(LAT )、枯草芽抱杆菌(AmyE或Ap巧)和链霉菌Ce IA。
[0189] 在另一方面中，提供编码酶多肤的核酸。核酸可编码包含具有指定氨基酸序列同 一性程度的氨基酸序列的酶。在一些实施方案中，核酸编码具有与亲本酶至少80%、至少 81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89%、 至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或甚至是至少99%氨基酸序列同一性的酶。在一些实施方案中，核酸具有与亲本酶至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%或甚至至少98%的核巧酸序列一致性。
[0190] 在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括编码具有缺失、插入或置换的酶 的核酸，诸如上文提及的那些。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的 多肤。
[0191] 在另一个实施例中，核酸在严格条件或极严格条件下杂交至与编码具有与亲本酶 至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、 至少97%、至少98%或甚至99%氨基酸序列同一性的酶的核酸互补的核酸。在一些实施方 案中，核酸在严格条件或极严格条件下杂交至与具有亲本酶的序列的核酸互补的核酸。此 类杂交条件描述于本文中但也是本领域中已知的。
[0192] 核酸可编码包含信号序列的"全长"（吁r或"FL")酶、仅酶的不含信号序列的成熟 形式、或酶的不含成熟形式的N末端或C末端的截短形式。优选地，核酸的长度足W编码活性 酶。
[0193] 编码酶的核酸能够可操作地连接至适用于在宿主细胞中表达酶的载体中的各种 启动子和调节子。示例性启动子来自地衣芽抱杆菌淀粉酶化AT)、枯草芽抱杆菌(AmyE或 Ap巧)和链霉菌CelA。此类核酸还可连接至其它编码序列例如W编码嵌合多肤。
[0194] 3.本发明的酶的产生
[01M]本发明的酶可在宿主细胞中例如通过分泌或细胞内表达来产生。包含酶的培养细 胞材料(例如，全细胞肉汤)可在将酶分泌至细胞培养基中之后获得。任选地，根据最终酶的 期望纯度，酶可从宿主细胞中分离或甚至是从细胞肉汤中分离。编码酶的基因可根据本领 域中熟知的方法克隆并表达。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植 物细胞（包括藻类）。尤其可用的宿主细胞包括黑曲霉（AspergiIlus niger)、米曲霉 (Aspergillus Oiyzae)或里氏木霉（Trichoderma reesei)。其它宿主细胞包括细菌细胞例 如枯草芽抱杆菌或地衣芽抱杆菌W及链霉菌。
[0196] 宿主细胞还可表达编码同源葡糖淀粉酶或异源葡糖淀粉酶（即不与宿主细胞同种 的葡糖淀粉酶，或一种或多种其它酶）的核酸。葡糖淀粉酶可为变体葡糖淀粉酶，诸如在例 如美国专利8，058，033扣aniSCO US公司）中公开的葡糖淀粉酶变体中的一种。另外，宿主可 表达一种或多种辅助酶、蛋白质或肤。运些可有益于液化、糖化、发酵、SSF过程。此外，宿主 细胞可产生除用于煮解各种原料的酶之外的生物化学品。此类宿主细胞可用于发酵或同时 糖化和发酵过程W减少或消除对添加酶的需要。
[0197] 3.1.载体
[019引包含编码酶的核酸的DNA构建体可被构造成在宿主细胞中表达。因为遗传编码中 熟知的简并性，所W编码相同氨基酸序列的不同多核巧酸可被设计并且利用常规技能制 备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域中熟知的。编码酶的核酸可结合到载体中。 载体可使用熟知的转化技术诸如下文公开的那些技术转移至宿主细胞。
[0199] 载体可为可转化至宿主细胞中且在宿主细胞内复制的任何载体。例如，作为繁殖 和扩增载体的方法，包含编码酶的核酸的载体可在细菌宿主细胞中转化和复制。载体还可 转化至表达宿主中，使得编码核酸可表达为功能性酶。充当表达宿主的宿主细胞可包括例 如丝状真菌。真菌遗传学库存中屯、(FGSC)菌株目录列出适用于在真菌宿主细胞中表达的载 体。参见FGSC，菌株目录，University of Missouri,在www.fgsc.net(2007年 1 月 17 日最后 一次修改）。代表性载体为PJG153,它是可在细菌宿主中复制的无启动子Cre表达载体。参见 化rrison等人（2011 Mpplied Elnviron.Microbiol .77:3916-22〇pJG153可利用常规技能修 饰W包含且表达编码酶变体的核酸。
[0200] 编码酶的核酸能够可操作地连接至合适的启动子，从而允许在宿主细胞中转录。 启动子可W是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任何DNA序列并且可源自编码与宿主细 胞同源或异源的蛋白质的基因。特别是在细菌宿主中用于指导编码酶的DNA序列的转录的 示例性启动子为大肠杆菌化.col i)的Iac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因dagA或celA启动子、地衣芽抱杆菌（Bacillus Iicheniformi S )a-淀粉酶基因（amyL)的启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus StearothermopM Ius)产麦芽糖淀粉酶基因（amyM)的启动子、解淀粉芽抱杆菌(Baci Ilus amy Ioliquef aciens)a-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽抱杆菌xy IA和巧IB基因的启动子 等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的示例为来源于编码W下的基因的启动子:米 曲霉(Aspergillus o;ryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉（I^iizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪 酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉憐酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酷胺酶。当编码酶的基因在菌 种诸如大肠杆困中表达时，合适的启动子可选自例如隧困体启动子，包括T7启动子和隧困 体A启动子。用于在酵母菌种中表达的合适的启动子的示例包括但不限于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1 和Gal 10启动子 W及己斯德毕赤酵母（Pichia pastor is) AOXl或A0X2启动子。C化1为里氏木霉的内源性诱导型启动子。参见Liu等人 (2008) ('Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohy化olase I gene(cbhl)p;romoter optimization!；通过纤维二糖水解酶I基因 (c化I)启动子优化改善里氏木霉中异源性基因表达）/'Acta Biochim.Biophys.Sin(上海） 40(2):158-65。
[0201] 编码序列能够可操作地连接至信号序列。编码信号序列的DNA可为与待表达的酶 基因天然相关联或来自不同的属或种的DNA序列。可将包含DNA构建体或载体的信号序列和 启动子序列引入至真菌宿主细胞中并且可来源于相同的来源。例如，信号序列为可操作地 连接至Cbhl启动子的Cbhl信号序列。
[0202] 表达载体还可包含合适的转录终止子和在真核生物中可选地连接至编码酶的DNA 序列的聚腺巧酸化序列。终止序列和聚腺巧酸化序列可适当地源自与启动子相同的来源。
[0203] 载体还可包含使得载体在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的示例为质粒 口11(：19、94〔￥(：177、9册110、祀194、94181和9口702的复制起点。
[0204] 载体还可包含选择性标记，例如其产物补充分离的宿主细胞中的缺陷的基因，诸 如枯草芽抱杆菌或地衣芽抱杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性例如氨节青霉素抗性、卡那 霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记诸如amdS、 argB、niaD和xxsC，具有潮霉素抗性，或选择可通过共转化来实现。
[0205] 细胞内表达可在一些方面中是有利的，例如当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞 W产生大量酶用于后续的富集或纯化时。酶向培养基中的细胞外分泌还可用于制备包含分 离的酶的培养细胞材料。
[0206] 表达载体通常包括克隆载体的组分，诸如例如允许载体在所选宿主生物中自主复 制的元件，和一个或多个为了选择目的在显型上可检测的标记。表达载体通常包含对照核 巧酸序列诸如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏蛋白基因或一 个或多个激活因子基因。另外，表达载体可包含编码能够将酶祀向宿主细胞细胞器官诸如 过氧化物酶体或祀向特定宿主细胞隔室的氨基酸序列的序列。此类祀向序列包括但不限于 序列SKL。为了在控制序列的指导下表达，酶的核酸序列W适于表达的方式可操作地连接至 巧制序列。
[0207] 用于分别连接编码酶、启动子、终止子和其它元件的DNA构建体，W及将它们插入 至含有为复制所必需的信息的合适的载体中的过程为本领域的技术人员所熟知(参见例如 Sambrook等人，Molecular CloningiA Laboratory Manual，第2片反，Cold Spring Harbor, 1989,和第 3版，2001)。
[020引 3.2.宿主细胞的转化和培养
[0209] 包含DNA构建体或表达载体的分离细胞有利地用作酶的重组产生中的宿主细胞。 细胞可用编码酶的DNA构建体，便利地通过将DNA构建体（W-个或多个拷贝）整合在宿主染 色体中来转化。运种整合一般被认为是一个优点，因为DNA序列更有可能被稳定地保持在细 胞中。可根据常规方法来进行DNA构建体向宿主染色体中的整合，例如通过同源重组或异源 重组来进行。另选地，细胞可用如上所述的表达载体结合不同类型的宿主细胞来转化。
[0210] 合适的细菌宿主生物的示例为革兰氏阳性菌菌种，诸如芽胞杆菌包括枯草芽抱杆 菌、地衣芽抱杆菌、迟缓芽抱杆菌、短乳杆菌、嗜热脂肪芽抱杆菌(先前为芽抱杆菌属）、嗜碱 芽抱杆菌、解淀粉芽抱杆菌、凝结芽抱杆菌、迟缓芽抱杆菌、巨大芽胞杆菌和苏云金芽抱杆 菌；链霉菌属种，诸如鼠灰链霉菌（Strepto町CeS murinus);乳酸菌种，包括乳球菌属 (Lactococcus sp.)，诸如乳酸乳球菌属（Lactococcus Iactis);乳杆菌属(Xactobacillus SP.)，包括罗伊氏乳杆菌(XactobaciIlus reuteri);明串珠菌属(Xeuconostoc sp.);小球 菌属（Pediococ州S sp.);和链球菌属（Streptococcus sp.)。另选地，可选择属于肠杆菌包 括大肠杆菌或属于假单胞菌科的菌株的革兰氏阴性菌菌种作为宿主生物。
[0211] 合适的酵母宿主生物可选自与生物技术相关的酵母种诸如但不限于酵母种类诸 如毕赤酵母属（Pichia sp.)、汉逊酵母属（Hansenula sp.)，或克鲁维酵母属 化Iuyveromyces)、耶氏酵母属（Yarrowinia)、裂殖酵母（Schizosaccharomyces)属或酵母 属的一种，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或属于裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)的一种，诸如例如像粟酒裂殖酵母（S.pombe)菌种。甲基营养酵母 菌种己斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株可用作宿主生物。另选地，宿主生物可为汉 逊酵母属菌种。在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属的菌种，例如黑曲霉、米曲霉、塔 宾曲霉（Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)或构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)。另选地，镶抱属菌种例如尖抱镶抱菌（Fusarium 0巧sporum)或 根毛霉(化izomucor)菌种诸如米黑根毛霉的菌株可用作宿主生物。其它合适的菌株包括嗜 热真菌属(Thermomyces)和毛霉菌菌种。此外，木霉属（Trichoderma SP.)诸如里氏木霉可 用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的合适的程序包括例如EP238023中所述的程序。真菌宿主 细胞表达的酶可为糖基化的，即将包含糖基部分。糖基化模式可与野生型酶中存在的相同 或不同。糖基化的类型和/或程度可使酶特性和/或生物化学特性发生变化。
[0212] 有利的是使表达宿主的基因缺失，其中该基因缺陷可由转化的表达载体来处理。 已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺 失、通过插入失活或通过使基因对于其指定用途而言无功能从而防止该基因表达有功能的 蛋白的任何其它方式而实现基因失活。可使木霉属(Trichoderma SP.)或已被克隆的其它 丝状真菌宿主的任何基因缺失，例如cbhl、c化2、egll和egl2基因。基因缺失可通过本领域 中已知的方法，通过将待失活的期望基因的一种形式插入到质粒中来实现。
[0213] 将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括诸如W下的技术:转化；电穿孔;细胞核 显微注射;转导;转染，例如脂质转染介导和DEAE-糊精介导的转染;与憐酸巧DNA沉淀一起 溫育；用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击；W及原生质体融合。一般转化技术在本领域中 是已知的。参见例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉