甲烷的微生物转化的制作方法
【专利说明】甲烧的微生物转化
[0001 ] 政府权益
[0002] 美国政府依据在美国能源部与可持续能源联盟有限责任公司（国家再生能源实验 室的管理者和操纵者)之间的合同号DE-AC36-08G028308对本发明具有权益。
[0003] 本发明是在政府扶持下依据美国能源部援助协议号DE-AR0000350、C抑A号81，135 得W完成。政府对本发明有某些权益。
技术领域
[0004] 本发明设及一种从含甲烧的原料产生至少一种产物的方法。所述方法包括向包含 至少一种嗜甲烧微生物于液体营养培养基中的培养物的生物反应器中提供包含014和化的 气态底物，W产生至少一种产物，如脂质和氨基酸。
【背景技术】
[0005] 全球能源危机已使人们对制造燃料的替代方法的兴趣增大。运输用生物燃料为汽 油的有吸引力的替代物并且作为低浓度共混物快速渗透着燃料市场。源于生物质的生物燃 料制造已经出现，作为增加替代能源的产量并且减少溫室气体排放的主要方法。从生物质 制造生物燃料可实现能源独立性，并且已显示会增强农村地区的发展与可持续的经济发 展。
[0006] 传统的液体生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、薦糖、玉米、油菜巧、大豆、栋 桐和植物油。第一代原料受到许多明显的挑战。运些碳水化合物原料的成本受其作为人的 食物或动物饲料的价值的影响，而栽培淀粉或薦糖生产作物来制造乙醇并非在所有地域都 在经济上可持续。持续使用运些原料作为生物燃料的来源将不可避免地对可耕地和水资源 造成大的压力。因此，感兴趣的是开发将较低成本和/或较富足的碳资源转化成燃料的技 术。
[0007] 第二代生物燃料为从纤维素和海藻制得的那些。由于快速的生长速率和海藻消耗 二氧化碳并产生氧的能力，因此选择海藻来产生脂质。
[000引还已经证明可W通过含一氧化碳的合成气的微生物转化来产生生物燃料。产乙酸 细菌，如来自醋杆菌属、穆尔氏菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、醋杆菌属、真杆菌属、酪酸杆菌 属、产醋杆菌属、甲烧八叠球菌属、甲烧八叠球菌属和脱硫肠状菌属的那些可W用于通过一 氧化碳和/或氨和二氧化碳的厌氧发酵来产生乙酸、乙酸醋和其它产物如乙醇。运些细菌通 过Wood-Uungdahl路径(其中乙酷基辅酶A合成酶为关键酶)将合成气转化成产物。例如，从 合成气产生乙酸醋和乙醇的梭状杆菌的各种菌株描述于WO 00/68407、EP 117309、美国专 利5，173,429、5,593,886和6,368,819、胖0 98/00558和胖0 02/08438中。
[0009] -个可见活力增强的领域为构成生物燃料制造所需的原料的脂质的微生物合成。 大量研究证明了通过对不同底物如工业甘油、乙酸、污水污泥、去蛋白乳清（whey permeate)、薦糖蜜和稻杆水解产物使用油脂酵母来积累脂质的能力。而且，运些第二代生 物燃料技术已经遇到由高制造成本W及与原料运输和存放相关的成本所造成的问题。
[0010] 甲烧在美国是由人类活动所排出的第二普遍的溫室气体。虽然甲烧的寿命比二氧 化碳短得多，但是其在俘获福射方面比二氧化碳更有效，因此在20年的时期内，甲烧对气候 变化的对比影响要比二氧化碳大70倍W上。天然气和石油系统是甲烧的最大工业来源，接 着是由农业和填埋废弃物产生的那些。利用甲烧/减少排放的现行策略已经集中于使用天 然气中的甲烧，W及从各种工业过程所回收的甲烧，作为可行的燃料来源。
[0011] 已知各种嗜甲烧细菌遍布自然界，其在好氧条件下能够组合氧与甲烧W通过酶： 甲烧单加氧酶和甲醇脱氨酶来形成甲醒。甲醒然后通过RuMP路径（I型嗜甲烧菌）或丝氨酸 路径QI型嗜甲烧菌）引入有机化合物中。已经定义了十一种嗜甲烧菌属，也即甲基球菌属、 甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基暖菌属、甲基卵菌属(methylovulum)、甲基海 洋分枝杆菌属(methyIomarinum)、甲基海洋生菌属(methyIomarinov皿）、甲基热菌属、甲基 抱囊菌属和甲基弯曲菌属。
[0012] 目前，嗜甲烧细菌的商业应用是受限的。SemrauJ.0.(2011)讨论了嗜甲烧菌对于 污染地点的生物修复，例如氯化控类如S氯乙締的降解的用途。WO 09/154683描述了嗜甲 烧菌在燃料电池中的用途，其中甲烧被燃料电池内的微生物氧化W产生电子。美国公布 2005/0221465和美国专利7，799，550描述了水解的、均化的嗜甲烧细菌生物质作为发酵用 营养素原料的用途。EP1641475描述了来自嗜甲烧细菌的脂质用于减少胆固醇的用途。美国 公布2003/0138878和EP 1320579B1描述了嗜甲烧细菌生物质作为蛋白质来源的用途。美国 公布2006/0057726描述了 一组通过同源重组对Cl代谢细菌中的染色体突变进行阳性选择 的基因工具。Kalyuzhnaya等（2011)的综述描述了嗜甲烧细菌的生物技术方面并且概述了 将利用甲烧的微生物用于制造依克多因（ectoine)的前景。Shoda等（1975)的研究概述了对 于在分批培养物中培育利用甲烧的细菌最优的氧气和甲烧分压。
[0013] 在本领域中仍需要从包含甲烧的气态底物产生有价值的产物，如生物燃料。本发 明的目的在于提供从包含甲烧的气态底物制造适用产物如脂质和氨基酸的新方法，并且向 公众提供减少对环境的甲烧排放的新方法，或者至少向公众提供适用的选择。
【发明内容】
[0014] 本发明对本领域中的需求作出反应。第一方面，提供一种通过对气态底物进行微 生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：
[0015] (a)向包含至少一种嗜甲烧微生物于液体营养培养基中的培养物的生物反应器提 供包含CH4和化的气态底物；W及
[0016] (b)将气态底物在发酵条件下微生物转化成至少一种在细胞生物质中的选自脂 质、蛋白质、氨基酸和其混合物W及分泌的脂肪酸的产物。
[0017] 在第一方面的具体实施方案中，所述方法产生脂质或氨基酸，或者其混合物。在具 体的实施方案中，脂质可包括但不限于脂肪酸、糖脂、銷脂、醋脂、聚酬、固醇脂、蕾烧类、憐 脂和异戊締醇脂质或其混合物。在具体的实施方案中，氨基酸可包括但不限于脯氨酸、5-氧 脯氨酸、丙氨酸、天口冬氨酸盐、谷氨酷胺和谷氨酸盐，或其混合物。
[0018] 在具体的实施方案中，由所述方法产生的脂质可转化成至少一种化学燃料或燃料 组分。例如，脂质可通过本领域熟知的手段转化成选自可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃 料、柴油燃料组分、脂肪酸甲醋(FAME)和脂肪酸乙醋(FAEE)的化合物。
[0019] 第二方面，提供一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方 法，所述方法包括：
[0020] (a)向含有液体营养培养基和至少一种嗜甲烧微生物的培养物的生物反应器提供 包含CH4和化的气态底物；
[0021] (b)微生物转化气态底物W产生至少一种在微生物的细胞生物质中的产物；W及
[0022] (C)从微生物的细胞生物质提取至少一种产物。
[0023] 在具体的实施方案中，将液体营养培养基连续地馈送到生物反应器中。在具体的 实施方案中，使液体营养培养基饱和含有化，随后馈送到生物反应器中。在具体的实施方案 中，对液体营养培养基加压并且使其饱和含有化，随后馈送到生物反应器中。
[0024] 在具体的实施方案中，未转化的气态底物和/或任何由微生物所产生的气体的至 少一部分从气体出口离开生物反应器。在具体的实施方案中，排气的至少一部分回收到生 物反应器中W进一步转化。在具体的实施方案中，将排气的至少一部分用作燃料。
[0025] 在具体的实施方案中，将至少一种微生物的培养物悬浮于液体营养培养基中。在 具体的实施方案中，将液体营养培养基维持在约6至约11的pH值范围内。在优选的实施方案 中，将液体营养培养基维持在约8至约9.5的pH值。在具体的实施方案中，将液体营养培养基 的溫度维持在约5°C与约6(TC之间。在优选的实施方案中，将液体营养培养基维持在约25°C 至约35°C的溫度下。
[0026] 在具体的实施方案中，一种或多种微生物为选自W下项的嗜甲烧细菌：甲基球菌 属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基八叠球菌属、甲基暖菌属、甲基海洋分枝 杆菌属、甲基海洋生菌属、甲基热菌属、甲基卵菌属、甲基抱囊菌属和甲基弯曲菌属。在具体 的实施方案中，嗜甲烧细菌选自芙膜甲基球菌、甲烧甲基单胞菌、甲基单胞菌属、甲基弯菌、 海洋甲基细菌(MethyIobacter marinus )、藤黄甲基细菌(MethyIobacter Iuteus )、甲烧氧 化菌和嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium buryatense)。在优选的实施方案中，嗜甲烧细菌 为嗜碱甲基微菌。
[0027] 在具体的实施方案中，嗜甲烧细菌为天然存在的菌株。在替代性实施方案中，嗜甲 烧细菌为工程化菌株。在具体的实施方案中，嗜甲烧细菌为选择的菌株。在具体的实施方案 中，选择的嗜甲烧菌株为甲基微菌属菌株5GB1。
[0028] 在具体的实施方案中，所述方法包括从至少一种微生物的细胞膜提取至少一种产 物的步骤。在具体的实施方案中，提取步骤包括湿法提取程序。在具体的实施方案中，提取 步骤在独立反应器中发生，直到转化步骤。在具体的实施方案中，包含至少一种产物和/或 至少一种微生物的产物流从反应器来到提取模块。
[0029] 在具体的实施方案中，提取步骤包括细胞破碎步骤，所述步骤使用高压均化、化学 或物理预处理，如(但不限于)酸或碱预处理生物质，W及加热到高于蛋白质变性溫度(在约 50°C与约200°C之间，优选地在约75°C与约90°C之间）。在具体的实施方案中，提取步骤进一 步包括溶剂萃取步骤。在具体的实施方案中，溶剂萃取步骤将产物流分成包含一种或多种 产物和溶剂的轻相W及包含废生物质的重相。
[0030] 在具体的实施方案中，溶剂为非极性烧控或短链醇或其任何组合。在优选的实施 方案中，溶剂为与微生物脂质组合物相容的己烧或替代性短链烧控(例如戊烧、庚烧)或短 链醇，例如下醇、异下醇、叔下醇、戊醇或任何其它溶剂(或溶剂系统组合）。可得微生物产物 的性质越具极性，应选择越具极性的溶剂体系。
[0031] 在具体的实施方案中，至少一种所提取的产物进一步来到产物加工模块。在具体 的实施方案中，将至少一种所提取的产物升级到可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃料、柴