专利名称：一种γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法
技术领域：
本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产的新方法。
背景技术：
Y -聚谷氨酸(Poly-Y-glutamatic acid, Y-PGA),是一种由多种微生物产生的水溶性和可生物降解的聚氨基酸。聚谷氨酸是一种对人体和环境无毒害的新型天然高分子，其独特的结构特性赋予高度吸水性、良好的渗透性、生物相容性和生物可降解性，广泛应用于农业、医药、食品、化妆品等许多领域，是一种公认的极有发展潜力的绿色化学产品。Y-聚谷氨酸的生产主要利用芽孢杆菌属的一些菌株，直接发酵生产。相对以石油衍生品为基础的聚合物，Y-聚谷氨酸合物能够通过可再生原料合成，具有相当大的市场潜力。Y -PGA生产方法分为两类一类是在发酵培养基中添加L-谷氨酸作为Y -PGA合成的前体，由微生物吸收培养基中的谷氨酸，并利用其合成酶系将单体谷氨酸聚合产生Y-PGA， 即谷氨酸依赖性合成方法，例如专利CN1644677A所述的Y-PGA生产方法；另外一类是在发酵培养基中不添加L-谷氨酸，有微生物直接将培养基中的糖质原料转化为内源性谷氨酸， 再由自身的合成酶系聚合产生Y-PGA，这称为从头合成，即谷氨酸非依赖性合成方法，也称为从头合成，例如专利CN 1932007A所述的Y-PGA生产方法。两种生产方法中，Y -聚谷氨酸生产水平很大程度上受到培养基成分和培养条件的影响。许多研究已经确定了生产Y-PGA的最佳培养基成分。通常使用的培养基包括碳源，氮源和无机盐类，L-谷氨酸依赖性合成方法需要加入大量外源谷氨酸作为聚谷氨酸的前体。一般来说合适的碳源通常是葡萄糖，甘油，麦芽糖，柠檬酸，果糖，蔗糖，淀粉等，合适的氮源通常是氯化铵，硫酸铵，蛋白胨，酵母膏等。已有大量文献报道了谷氨酸依赖性合成方法生产聚谷氨酸的方法，包括培养基组分的优化，间歇发酵和流加发酵方法，Y-PGA的提取分离方法等。流加发酵的方式包括流加糖类为细胞生长和聚合物合成提供能量(参见专利CN1556859A);流加L-谷氨酸前体增加聚谷氨酸产量。目前的发酵生产聚谷氨酸的方法中，培养基中需要添加谷氨酸作为前体导致了高的原料成本，成为工业化生产和应用的主要瓶颈之一。而不添加谷氨酸的发酵过程，只能产生低浓度的聚谷氨酸，过低的生产效率不适合工业化规模的生产。因此，通过开发新的发酵生产方法，以较为廉价的底物替代L-谷氨酸，生产高浓度的Y-聚谷氨酸，成为市场的新需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，能够以较为廉价的成本，生产高浓度的Y -聚谷氨酸。本发明方法所采用的技术方案包括如下步骤将芽孢杆菌属微生物接种到含有发酵培养基的发酵容器中，在有氧条件下培养，发酵过程中持续搅拌，向发酵培养基中流加有机酸，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生Y-聚谷氨酸。其中有机酸浓度维持在5 20g/L之间,芽孢杆菌属微生物选自枯草芽孢杆菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏号CGMCC No. 4924)或枯草芽孢杆菌ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏号CGMCC No. 1250)菌株。向发酵培养基中流加的有机酸选自柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、a-酮戊二酸、延胡索酸、苹果酸或草酰乙酸中的任意一种，或上述任意一种有机酸的盐；在补料分批发酵过程中机酸是以恒速流加或间歇流加的方式加入发酵培养基。向发酵培养基中流加有机酸的同时也可以流加氮源、碳源和无机盐，使氮源浓度维持在I 10g/L，其中氮源选自氯化铵、玉米粉、硫酸铵、蛋白胨牛肉膏或酵母膏中的任意一种本发明的方法中，有机酸添加到培养基中后，其作用是作为Y-PGA合成的间接前体，发酵过程中，被菌体吸收转化成为内源性谷氨酸，增加聚谷氨酸的产量。发酵培养基中除有机酸之外的其他成分包括现有用于生产Y-聚谷氨酸的氮源、 碳源和无机盐。如使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉作为碳源；使用氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉等作为氮源；也包括菌体生长所需的各种无机盐如铁盐，镁盐， 钾盐，钙盐，磷酸盐。本发明和现有技术相比具有以下有益效果本发明方法使微生物持续产生高浓度Y-聚谷氨酸，而所使用的培养基中避免了添加昂贵的谷氨酸，合成所需要的底物为廉价糖质原料和有机酸，具有成本优势。使用本发明的方法生产聚谷氨酸，通过向发酵培养基中流加有机酸使其维持在一定的浓度范围内，一方面避免了有机酸对于菌体细胞的毒性和生长抑制作用，另一方面促使菌体持续不断合成Y-PGA，显著增加Y-PGA产量，其浓度最高可达到38g/以上。本发明的方法周期短，易于操作，可用于工业规模的生产。
图I是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL发酵罐中添加柠檬酸分批发酵过程曲线图。(图中▲表示残余葡萄糖浓度， 表示Y-PGA浓度，■表示菌体干重， 表示残余柠檬酸浓度)图2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL发酵罐中分批补料发酵过程曲线图(恒速流加柠檬酸溶液)。(图中▲表示残余葡萄糖浓度， 表示Y-PGA浓度，■ 表示菌体干重， 表示柠檬酸浓度，一表示恒速流加柠檬酸)图3是是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ClO在IOL发酵罐中分批补料发酵过程曲线图(间歇流加柠檬酸和氯化铵溶液)。(图中▲表示残余葡萄糖浓度，〇表示Y-PGA 浓度，□表示细胞干重， 表示柠檬酸浓度，丨表示流加柠檬酸和氯化铵混合溶液。)图4是分批发酵和两种补料分批发酵的结果比较图。(补料分批发酵I表示恒速流加柠檬酸；补料分批发酵2表示间歇流加柠檬酸和氯化铵混合溶液。)
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范
实施例IY-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，包括以下步骤步骤I)菌株活化将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ClO在平板上划线，37°C，培养12h。平板培养基组成为 蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L,氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L,琼脂15g/L, pH 7。步骤2)种子的制备将活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO菌种挑取接入液体种子培养基，装液量为250ml三角瓶20ml培养基，37°C，200rpm (转/分钟)，振荡培养12h。上述的种子培养基组成蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖IOg/ L,pH 7。步骤3)将制备好的种子液按5%的比例接入IOL发酵罐，发酵培养基装液量为 6L，发酵参数控制为发酵温度37°C，搅拌400rpm，pH6. 5，通气量0. 4L/h，发酵34h。上述的发酵培养基组成葡萄糖80g/l，氯化铵10g/l，柠檬酸20g/l，KH2P04
0.5g/l,MgS04 *7H20 0. 5g/l,FeC13 0. 05g/l, MnS04 H200. lg/1, CaC12 0. llg/l,pH 6. 5 ； 当发酵培养基中柠檬酸浓度低于5g/L时，开始恒速流加浓度为250g/L的柠檬酸钠溶液，维持培养基中柠檬酸浓度为5 10g/L左右。培养基中Y-PGA浓度不再增加时停止流加。步骤4)产物分离提取发酵结束后离心除去发酵液中的菌体，上清液中加入4倍体积甲醇，4°C放置lh，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到白色y-PGA。发酵结果显示，最终消耗葡萄糖46g/L，消耗柠檬酸31. lg/L，Y-PGA的产量为34. 5g/L，发酵过程曲线见图2。实施例2步骤I)与实施例I中的步骤I)相同。步骤2)与实施例I中的步骤2)相同。步骤3)与实施例I中的步骤3)除了以下区别，其余技术特征相同，区别在于当发酵培养基中柠檬酸浓度低于5g/L时，开始间歇流加柠檬酸和氯化铵的混合溶液，浓度分别为250g/L和48g/l，维持培养基中柠檬酸浓度为5 20g/L左右，氯化铵浓度为l_10g/L。 培养基中Y-PGA浓度不再增加时停止流加。步骤4)与实施例I中的步骤4)相同。发酵结果显示，最终消耗葡萄糖57g/L，消耗柠檬酸29. 8g/L，y -PGA的产量为 38. 2g/L，发酵过程曲线见图3。对比例I步骤I)与实施例I的步骤I)相同。步骤2)种子的制备将活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO菌种挑取接入液体种子培养基，装液量为IOOOml三角瓶250ml培养基，37°C，200rpm,振荡培养12h。上述的种子培养基组成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化钠5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步骤3)将制备好的种子液按5%的比例接入10L发酵罐，发酵培养基装液量为 6L，发酵参数控制为发酵温度37°C，搅拌400rpm，pH6. 5，通气量0. 4L/h，发酵34h。上述的发酵培养基组成葡萄糖80g/l，氯化铵10g/l，柠檬酸20g/l，KH2P04
0.5g/l,MgS04 *7H20 0.5g/l，FeC13 0.05g/l,MnS04 *H200. lg/l,CaC12 0.llg/l，pH 6.5。步骤4)与实施例I的步骤4)相同。发酵结果显示，最终消耗葡萄糖26g/L，消耗柠檬酸20g/L，Y-PGA的产量是27. 7g/L，发酵过程曲线见图I。对比例I是在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO中一次性加入有机酸发酵 (分批发酵)的方式产生Y -PGA，实施例I是进行恒速流加有机酸(补料分批发酵I)的方式下产生Y-PGA，实施例2是进行间歇流加有机酸(补料分批发酵2)的方式下产生 Y-PGA，对比例I与实施例I和2的发酵结果进行比较，可以发现两种流加发酵(补料分批发酵)的产量明显高于分批发酵。(参见图4)实施例3步骤I)与实施例I中的步骤I)相同。步骤2)与实施例I中的步骤2)相同。步骤3)将制备好的种子液按5%的比例接入IOL发酵罐，发酵培养基装液量为 6L，发酵参数控制为发酵温度37°C，搅拌400rpm，pH6. 5，通气量0.4L/h。当发酵培养基中琥珀酸浓度低于5g/L时，开始间歇流加浓度为50g/L的琥珀酸钠溶液，维持培养基中琥珀酸浓度为5 10g/L左右。培养基中Y -PGA浓度不再增加时停止流加。上述的发酵培养基组成葡萄糖80g/l，氯化铵10g/l，琥珀酸20g/l，KH2P04 I.5g/l,MgS04 *7H20 0.5g/l，FeC13 0.05g/l,MnS04 *H200. lg/l,CaC12 0.llg/l，pH 6.5。步骤4)与实施例I中的步骤4)相同。发酵结果显示，最终消耗葡萄糖28g/L，消耗琥珀酸25.4g/L，Y-PGA的产量是 24. lg/L.实施例3是在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO中间歇流加琥拍酸产生的 Y-PGA的方式。对比例2Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，包括以下步骤步骤I)菌株活化将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在平板上划线， 37°C，培养12h。平板培养基组成为蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖IOg/ L，琼脂 15g/L，pH 7。步骤2)种子的制备将活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO菌种挑取接入液体种子培养基，装液量为250ml三角瓶20ml培养基，37°C，200rpm (转/分钟)，振荡培养12h。上述的种子培养基组成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化钠5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步骤3)摇瓶发酵将制备好的种子液按5%的比例接入发酵培养基，装液量为 250ml三角瓶30ml培养基，37°C，200rpm,振荡培养36h。上述的发酵培养基组成葡萄糖120g/L，氯化铵18g/L，KH2P04 5g/L，MgS04 -7H20 0.5g/L，FeC13 0. 05g/L，MnS04 H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述组分外，该发酵培养基中添加有机酸，如琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、异柠檬酸、a -酮戊二酸或延胡索酸中的任意一种，添加量为10g/L。步骤4)产物分离提取发酵结束后离心除去发酵液中的菌体，上清液中加入4倍体积甲醇，4°C放置lh，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到白色y-PGA。不同种类有机酸对细胞生长和Y-PGA产量的影响见表I。
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实验结果表明，添加10g/L 到 15. 4g/L。表I有机酸对细胞生长和Y -PGA产量的影响
权利要求
1.一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，其过程如下将芽孢杆菌属微生物接种到含有发酵培养基的发酵容器中，在有氧条件下培养，发酵过程中持续搅拌；向发酵培养基中流加有机酸，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生 Y-聚谷氨酸。
2.根据权利要求I所述的一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于， 当有机酸浓度低于5g/L时，开始流加有机酸溶液，使其维持到5-20g/L。
3.根据权利要求I所述的一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于， 所述的向发酵培养基中流加的有机酸选自柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、α -酮戊二酸、延胡索酸、苹果酸或草酰乙酸中的任意一种，或者上述任意一种有机酸的盐。
4.根据权利要求I所述的一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于， 所述的芽孢杆菌属微生物选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌选用枯草芽孢杆菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏号CGMCC No. 4924)或枯草芽孢杆菌 ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏号 CGMCC No. 1250) M株。
6.根据权利要求2所述的一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于， 所述的有机酸是以恒速流加或间歇流加的方式加入发酵培养基。
7.根据权利要求2所述一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，向发酵培养基中流加有机酸的同时也流加氮源、碳源和无机盐，使氮源浓度维持在I IOg/ L0
8.根据权利要求7所述一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所述的氮源选自氯化铵、硫酸铵、玉米粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了提供了一种γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法。现有技术生产的γ-聚谷氨酸浓度低的、成本高。本发明在培养需氧芽孢杆菌(Bacillus sp.)过程中，通过向培养基中流加有机酸或有机酸与氮源的混合物，促使菌体将糖质原料和有机酸转化为γ-聚谷氨酸，培养基中不需要另外添加前体物L-谷氨酸。本发明生产γ-聚谷氨酸的发酵方法周期短，易于操作，可用于工业规模的发酵，具有很好的应用价值。
文档编号C12R1/07GK102586353SQ20121006196
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者张慧莉, 徐志南, 蔡谨, 黄磊 申请人:浙江德清汇宁生物科技有限公司