专利名称：耐盐基因CcSOS1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及耐盐基因CcSOSl及其应用。
背景技术：
菊花(Chrysanthemum grandif lorum)，菊科多年生草本植物，其中切花菊是世界四大切花之一，菊花原产于我国，因为大自然赋予它丰富的花色、多变的花型以及易于栽培等特点，使其深受广大人民的喜爱。近年来切花菊在切花消费中占有很大的比重，其栽培面积已位居我国切花生产的首位。随着全球土壤盐渍化的不断加重，菊花的生产面临着严重的挑战，传统的物理和化学方法改造土壤不仅耗资巨大，而且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化。由于植物耐盐性状本身的复杂性，采用传统的育种方法已经很难获得耐盐优良品种。生物技术不断的发展，导入外源基因提高植物抗盐性已成为现代植物育种的主要手段。SOSl基因是质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因，除了负责将过多的Na+排出细胞之外，还控制Na+从根到茎的长距离运输，并且有数据显示转拟南芥AtSOSl基因可显著提高转基因植株的耐盐性(任仲海，等2002 ；周晓馥，等2002 ；Shi,等2000)。鉴于质膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐方面的作用，目前许多编码该蛋白的基因已经被克隆，既有从非盐生植物中克隆出来的，如芦苇WiaNHAl (Takahashi等，2006)、水稻 OsSOSl (Martinez-Atienza等，2007)、星星草PtSOSl (程玉祥，2008)，也有从耐盐的植物中克隆得到的，如胡杨PeSOSl (Wu等，2007)、小盐芥ThSOSl (Oh等，2007)等。在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将耐盐基因CcSOSl构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐盐特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。参考文献[IjMukherjee K, Roy Choudhury A, Gupta B, Gupta S，SenguptaDN(2006)AnABRE-binding factor, 0SBZ8, is highly expressed in salt tolerant cultivars than in salt sensitive cultivars of indica rice.BMC Plant Biol 6:18[2]Martinez-Atienza J, Jiang X Y, Garciadeblas B, et al. Conservation of the salt overly sensitive pathway in Rice. Plant Physiol,2007,143 :1001-1012[3]Prior C, Potier S, Souociet J L, et al. Characterization of the NHAl gene encoding a Na+/H+ antiporter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett,1996,387(1) :89-93[4] Shi H Z, Ishitani M, Kim C, et al. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOSl encodes a putative Na+/H+ antiporter. ProcNatlAcadSci USA, 2000,97 :6896-6901
[5]Wu SJ, Ding L，Zhu JK. S0S1，a genetic locus essential for salt tolerance and potassium acquisition. Plant Cell，1996，8 :617-627[6]管志勇，陈发棣，陈素梅，唐娟，杨帆.NaCl胁迫对2个菊属野生种幼苗体内K+、 Na+和Cl—分布及生长的影响.生态学报，2010，30 (12) :3198-3205[7]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].高等教育出版社，2000.[8]任仲海，马秀灵，赵彦修等.Na+/H+逆向转运蛋白和植物耐盐性.生物工程报， 2002，18(1) 16-1[9]王宝山，赵可夫.小麦叶片中K+、Na+提取方法的比较.植物生理学通讯，1995， 31(1) 50-52[10]周晓馥，王兴智.植物耐盐相关基因S0S基因家族研究进展遗传，2002， 24(2) :190192[11]张常青，洪波，李建科，等.地被菊花幼苗耐旱性评价方法研究[J].中国农业科学，2005，38 ) :789-796.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的耐盐基因CcSOSl。本发明的另一目的是提供该基因的应用。本发明的又一目的是提供一种通过转CcSOSl基因提高菊花抗盐性的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现耐盐基因CcSOSl，其核苷酸序列为SEQ ID No. 1。所述的耐盐基因CcSOSl编码的蛋白质。含有所述的耐盐基因CcSOSl的植物表达载体。所述的耐盐基因CcSOSl在提高菊花抗盐性方面的应用。所述的含耐盐基因CcSOSl的植物表达载体在提高菊花抗盐性方面的应用。一种提高菊花抗盐性的方法，该方法包括如下步骤(1)构建CcSOSl基因的植物表达载体将所述的CcSOSl基因插入表达载体得到含耐盐基因CcSOSl植物表达载体；(2)采用农杆菌介导法将含CcSOSl基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。步骤(1)的具体方法优选以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，反转录为 cDNA,以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOSl基因的上下游分别引入MlI和 KpnI 酶切位点，上游引物为=CcSOSl-Sal-F =SEQ ID N0. 2，下游引物为 CcSOSl-Kpn-R :SEQ ID NO. 3，将扩增出来的含有CcSOSl完整开放阅读框的PCR产物片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态，提取阳性质粒，由Mil和KpnI双酶切得到的CcSOSl基因片段，与 SalI和KpnI双酶切的线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CcS0Sl构建成功。步骤⑵的具体方法优选制备感受态的农杆菌，将步骤⑴中构建的含有 CcSOSl基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CcS0Sl转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基上预培养2 3d，然后进行农杆菌侵染8min，含有CcSOSl基因表达载体的农杆菌菌液OD值为0. 5 0. 6，侵染后用滤纸吸干叶盘外表的菌液，然后将叶盘放到共生培养基上黑暗培养3d，最后转入筛选培养基上继代培养 3 4代，等分化出的抗性芽长至2 3厘米时，将抗性芽转入到生根培养基上培养，初步获得抗性植株；其中所述的预培养培养基MS+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培养培养基MS+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；所述的筛选培养基MS+潮霉素10mg/L+ 羧苄青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/ L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；所述的生根培养基1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸 0. lmg/L。所述的提高菊花抗盐性的方法，还包括步骤C3)将转CcSOSl基因初步获得的抗性植株进行PCR检测和荧光定量PCR检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；其中，所述的PCR检测方法为取生根筛选得到的抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采用CTAB法提取基因组 DNA，将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为980bp， 引物序列为=HII-I =SEQ ID NO. 4，HII-2 =SEQ ID NO. 5 ；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-I和HII-2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；所述的荧光定量PCR检测方法为每个样品重复3次，建立扩增体系，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为 295bp，引物序列为=SOS-JC-Fl :SEQ ID NO. 6，SOS-JC-Rl :SEQ ID NO. 7 ；以扩增的GAPDH基因片段为内标，扩增片段长度为260bp，引物序列为GAPDH-F =SEQ ID NO. 8，GAPDH-R =SEQ ID NO. 9，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。所述的农杆菌菌株为EHA105。有益效果本发明从盐生植物大岛野路菊首次克隆了一个新的耐盐基因CcSOSl，通过将 CcSOSl基因整合到菊花基因组中，通过高盐试验分析获得耐高盐的转基因菊花株系。结果发现，与野生型株系相比，转CcSOSl的植株耐盐能力得到很大提高，而野生型植株抗性很弱。利用本方法可以显著提高菊花的耐盐性，为利用基因工程技术选育菊花抗盐性品种提供了新颖的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。。
图1 植物重组表达质粒pCAMBIA1301_CcS0Sl片段图谱图2 植物表达载体构建酶切验证3 转基因切花菊的转化和再生过程A，转化叶盘分化出愈伤组织；B，转化叶盘分化出抗性芽；C，生根筛选；D，抗性植株图4 转CcSOSl基因植株的PCR检测结果M =Marker ；CK+ 阳性质粒；CK-野生型植株；1-14 转基因植株
图5 荧光定量PCR检测CcSOSl基因在转基因和野生型植株的表达WT 野生型植株；S1-S12 转CcSOSl基因株系图6 转基因植株和野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析a 转基因植株与野生型植株盐胁迫处理后恢复生长；b 转基因株系与野生型植株盐处理后恢复生长存活率统计图7 转基因植株与野生型植株盐水培胁迫处理后生长状态变化图8 转基因植株与野生型植株盐水培处理后生理指标的检测a 盐胁迫下单株受害叶面积比率；b 盐胁迫下叶片相对电导率变化；c 盐胁迫下叶绿素(a+b)含量；d 盐胁迫下脯氨酸含量变化；e 盐胁迫下SOD活性变化；f 盐胁迫下 POD活性变化图9 转基因植株与野生型植株盐水培处理后植物体内Na+含量的变化图10 转基因植株与野生型植株盐水处理后植物体内K+含量的变化
具体实施例方式下面对发明的具体实施例进行详细的说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。实施例11、植物表达载体pCAMBIA 1301_CcS0Sl的构建以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa) 取1 μ g总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOS 1基因的上下游分别引入Ml I和KpnI酶切位点，上游引物为 CcSOSl-Sal-F :GGGTCGAC ATG GGA TCG GTG GCA AAC AAC GT (SEQ ID NO. 2)，下游引物为 CcSOSl-Kpn-R :GGGGTACC TTA GGG AGC TCG GGG GA (SEQ ID NO. 3)。50 μ L 反应体系 10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, CcSOSl-Sal-F, CcSOSl-Kpn-R 弓 | 物各 1· 0 μ L (20 μ mol · L-1)， dNTP mix 4. 0μ L(2. 5mmol · L-1)，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase。· 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反应程序95°C预变性 ％iin，然后 94°C解链 30sec，55°C退火 30sec， 72°C延伸％iin，反应35个循环，72°C延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(I1aKaRa)连接到T-载体(TaKaRa)，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定，测定序列为SEQ ID N0. 1。提取含有目的片段的T-载体及表达载体PCAMBIA1301质粒DNA并双酶切，酶切体系为10XBuffer T7. 5 μ L，BSA5 μ L, Sail 2. 0 μ L, KpnI 2.0yL，质粒 DNA 10 μ L, ddH20 补齐至50μ L，37°C过夜充分酶切。将含有CcSOSl完整开放阅读框的片段和pCAMBIA1301 线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为T4 Buffer 2.0yL，T4连接酶1. 0 μ L，载体回收液1. 0 μ L，目的基因回收液4. 0 μ L，dd H2O补齐至20 μ L，4°C过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-CcS0Sl转化T0P10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证(图1和图2)。2、农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花制备感受态的农杆菌，将CcSOSl基因的植物表达载pCAMBIA1301_CcS0Sl转入感受态的农杆菌菌株中，详细过程从YEB (50 μ g/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50 μ g/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm, 培养至OD值0. 5，然后菌液冰浴30min，将菌液转移到干净的离心管中，4000rpm离心，收集菌体，将菌体悬浮于2mL预冷的IOOmMCaCl2 QO%甘油)溶液中，200 μ L/管分装，待用。取5yL pCAMBIA 1301_CcS0Sl载体质粒，加入200 μ L ΕΗΑ105感受态细胞，搅拌混勻，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C 5min,加入800 μ L YEB液体培养基，28 0C 200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素) 固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。用YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素)液体培养基培养包含CcSOSl基因的植物表达载体的农杆菌EHA105 ；以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将大岛野路菊中克隆得到的CcSOSl基因导入‘神马’取组培瓶中‘神马’苗顶端叶盘 (0. 5cmX0. 5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液 (0D为0. 5 0. 6)中感染8min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再接种到共培养基上黑暗中培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3 4代，两周继代一次，逐渐降低筛选压，等分化出的抗性芽长至2 3cm时，将抗性芽转入生根培养基上进行筛选，初步获得抗性植株(图 3)。菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5. 8，lOOKpa、121°C灭菌25分钟。预培养培养基MS+6_苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L。共培养培养基MS+6_苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L。筛选培养基依次分别为MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素500mg/L+6_苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6_苄氨基嘌呤Img/ L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/L+6_苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸
0.lmg/L。生根培养基d/^MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0. lmg/L。3、转CcSOSl基因抗性植株的分子检测(PCR及荧光定量PCR)(I)PCR 检测取生根筛选得到的潮霉素抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA。将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为 980bp,引物序列为:HII-1 :CGTCTGTCGAGAAGTTTC(SEQ ID NO. 4)，HII-2 TACTTCTACACAGCCATC(SEQ ID NO. 5)；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-I和HII-2为引物，进行PCR检测。扩增体系为:2. 5yL 10XPCR Buffer,
1.5μ L 2. 5mmol ‘ L-1 MgCl2, 2 μ LdNTP, ΗΙΙ—1 禾口 ΗΙΙ—2 各 1 μ L，1 μ L DNA 模板，0· 2μ L 5U · μ L-1Taq酶，去离子水补足25 μ L0扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C 退火45s，72°C延伸lmin，35个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转CcSOSl基因的植株中有9个株系扩增出与阳性对照相同的特异性条带，野生型植株中没有扩增出条带。(2)荧光定量RT-PCR检测采用TaKaRa公司生产的RNAiso Reagent试剂盒，提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量qRT-PCR对CcSOSl基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立25μ L扩增体系；扩增条件为95°C预变性-Imin ；95°C变性-1 ，60°C退火-1 ， 72°C延伸-45s，40个循环。每个样品重复3次，试验数据由Roter Gene 6. O和Excel软件分析，采用△ ACt法进行基因相对表达分析，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物片段长为^^bp，引物序列为=SOS-JC-Fl CATACCAAGTCTAGGCAGCATC(SEQ ID NO. 6)，SOS-JC-Rl GACTTTCACTTGCTATTTCTCCC(SEQ ID NO. 7)以扩增的 GAPDH 基因片段为内标，扩增片段长度为 260bp,引物序列为GAPDH-F :CTGCTTCTTTCAACATCATTCC (SEQ ID NO. 8)， GAPDH-R :CTGCTCATAGGTAGCCTTCTTC (SEQ ID NO. 9)。根据荧光定量 PCR 检测结果(图 5)， 转基因株系中CcSOSl基因的表达量显著高于野生型植株，其中株系S11、S12表达量相对最高。证实CcSOSl基因已经转入到切花菊基因组DNA中并表达。4、转基因植株后代的抗性分析(1)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析为检测转基因植株的耐盐性，对转基因株系Sll、S12进行了盐胁迫处理。将生长一致的转基因植株及未转基因植株各9株种植于塑料杯中，各株系重复3次，栽培基质为按 1 1比例混合的营养土 蛭石混合物，种植于温室(23士2°C，12h光周期)中，待转基因及未转化植株展叶8 10片叶时控水处理7d，然后浇灌200mmol/L的NaCl溶液7d，然后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率， 存活率采用极限恢复法(张常青等，2005)。由图6可以看出，盐胁迫处理后，转基因株系S11、S12的大部分植株顶端仍然保持绿色，只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为80% 90%;野生型植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率仅为50%。(2)转基因株系及野生型植株盐胁迫后各项生理指标的检测采集转基因株系和野生型植株生长一致的扦插苗，当叶片长至8 10片叶时，用 200mmol/LNaCl进行水培处理，放置于23士2°C，12h光周期环境中，然后分别在0d、2d、4d、 6d、8d进行取样(植物叶片)，测量盐胁迫下单株受害叶面积比率、叶片相对电导率、叶片叶绿素(a+b)含量、脯氨酸含量以及SOD和POD活性变化。单株受害叶面积比率采用管志勇等的方法(2010)，叶片相对电导率、叶绿素含量的测定采用李合生等的方法(2000)，游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸方法测定(李合生等，2000)，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法，SOD采用氮蓝四唑(NBT)法，POD活性采用愈创木酚法。数据分析采用SPSS(SPSSRelease10. 0. 1)软件；作图用EXCEL系统。由图7可以看出，对转基因株系Sll、S12以及野生型植株进行盐胁迫处理。随着盐处理时间的延长，与WT植株相比，SlU S12转基因株系萎蔫进程较慢，WT植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，而转基因株系大部分仍保持绿色。由图8中a可以看出，盐胁迫下，S11、S12转基因株系的单株受害叶面积比率明显低于野生型植株，盐处理第4d时，野生型植株的受害叶面积比率已经达到了 50%，是转基因植株的2. 5倍。当盐处理到第8d时，野生型植株受害叶面积比率已经接近于100%。由图8中b可以看出，盐处理下转基因植株与野生型植株相对电导率表现出显著性差异，尤其在盐处理第8d时，对照比转基因株系高1.5倍。表明Sll、S12转基因株系的耐盐性明显高于野生型植株。由图8中c可以看出，所有植株的叶绿素含量都随着盐处理时间的延长而逐步下降，但是野生型植株叶绿素含量的下降幅度显著大于Sll、S12转基因株系，当盐处理进行第8天时，转基因植株的叶绿素含量是对照的3倍，差异显著。由图8中d可以看出，Sll、S12转基因株系及野生型植株中脯氨酸含量水平随时间呈缓慢升高状态，盐处理的前4天中，野生型植株中的脯氨酸含量水平略高于Sl 1、S12植株。4d后，S11、S12植株中脯氨酸含量继续升高，而野生型植株的脯氨酸含量上升趋于缓慢，总体上含量低于转基因株系。由图8中e可以看出，转基因株系及野生型植株中SOD活性水平均呈现缓慢升高状态，但Sll、S12转基因株系的SOD活性水平变化幅度较大，明显高于野生型植株。由图8中f可以看出，转基因株系及野生型植株中POD活性变化趋势稍有不同，野生型植株中POD活性呈缓慢升高的状态，而S11、S12转基因株系在处理第二天时，POD活性水平迅速升高，第4d时达到最低水平，随后继续呈现较快的升高状态，POD活性水平明显高于野生型植株，转基因株系及野生型植株盐胁迫后离子含量检测。(3)转基因株系及野生型植株盐胁迫后离子含量检测采集转基因植株和野生型植株生长一致的扦插苗，用200mmOl/LNaCl进行水培处理，分别在0d、2d、4d、6d、8d对植株4个部位进行取样，取样部位分别为上位叶、中位叶、茎和根，然后检测不同时间点植株各部分Na+、K+含量变化。Na+、K+的提取参照王宝山和赵可夫(19卯)的方法略加改动，Na+、K+含量用Optimal 2100DV电感耦合等离子体发射光谱仪 (Perkin Elmer)进行测定。由图9、10可以看出，盐胁迫下转基因植株和野生型植株体内的Na+主要分布在中位叶中，其次是上位叶、茎和根中，而且随着盐处理时间的延续，不同部位的Na+含量呈逐步上升的趋势，但是，相比较野生型植株，转基因植株各个部位的Na+含量均明显低于野生型植株。盐胁迫下，K+在植物体的分布主要集中在根、茎，然后是中位叶和上位叶，与Na+的分布正好相反，而且随着盐处理时间的延续，K+在不同部位的变化趋势与Na+的变化趋势也不同，随着时间的变化，K+在转基因植株及野生型植株的上位叶上呈现逐步下降趋势，而在中位叶、茎和根中，K+都表现出先升高再降低的趋势，但总体上，转基因植株不同部位的K+含量明显高于野生型植株。
权利要求
1.耐盐基因CcSOSl，其特征在于核苷酸序列为SEQID No. 1。
2.权利要求1所述的耐盐基因CcSOSl编码的蛋白质。
3.含有权利要求1所述的耐盐基因CcSOSl的植物表达载体。
4.权利要求1所述的耐盐基因CcSOSl在提高菊花抗盐性方面的应用。
5.权利要求3所述的含耐盐基因CcSOSl的植物表达载体在提高菊花抗盐性方面的应用。
6.一种提高菊花抗盐性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)构建CcSOSl基因的植物表达载体将所述的CcSOSl基因插入表达载体得到含耐盐基因CcSOSl植物表达载体；(2)采用农杆菌介导法将含CcSOSl基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。
7.根据权利要求6所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于步骤(1)的具体方法为以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOSl基因的上下游分别引入MlI和KpnI酶切位点，上游引物为CcSOSl-Sal-F =SEQ ID NO. 2，下游引物为 CcSOSl-Kpn-R :SEQ ID NO. 3，将扩增出来的含有CcSOSl完整开放阅读框的PCR产物片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态，提取阳性质粒，由Mil和KpnI双酶切得到的CcSOSl基因片段，与Mil和KpnI双酶切的线性化的表达载体PCAMBIA1301连接，转化Τ0Ρ10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CcS0Sl构建成功。
8.根据权利要求7所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于步骤O)的具体方法为制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CcSOSl基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CcS0Sl转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基上预培养2 3d，然后进行农杆菌侵染8min，含有CcSOSl基因表达载体的农杆菌菌液OD值为0. 5 0. 6，侵染后用滤纸吸干叶盘外表的菌液，然后将叶盘放到共生培养基上黑暗培养3d，最后转入筛选培养基上继代培养3 4代，两周继代一次，继代过程中逐渐降低筛选压，等分化出的抗性芽长至2 3厘米时，将抗性芽转入到生根培养基上培养，初步获得抗性植株；其中所述的预培养培养基MS+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培养培养基MS+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；所述的筛选培养基依次为MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/L+6-苄氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；所述的生根培养基1/2MS+ 潮霉素 8mg/L+ 萘乙酸 0. lmg/L。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于还包括步骤(3)将转CcSOSl基因初步获得的抗性植株进行PCR检测和荧光定量PCR检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；其中，所述的PCR检测方法为取生根筛选得到的抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为980bp，引物序列为=HII-I =SEQ ID NO. 4，HII-2 =SEQ ID NO. 5 ；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-I和HII-2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；所述的荧光定量PCR检测方法为每个样品重复3次，建立扩增体系，根据数据分析得到各个样品的Ct值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为295bp，引物序列为=SOS-JC-Fl :SEQ ID NO. 6，SOS-JC-Rl :SEQ ID NO. 7 ；以扩增的 GAPDH基因片段为内标，扩增片段长度为260bp，引物序列为=GAPDH-F =SEQ ID NO. 8，GAPDH-R =SEQID NO. 9，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。
10.根据权利要求6 8中任一项所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。
全文摘要
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，公开了耐盐基因CcSOS1及其应用。耐盐基因CcSOS1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。所述的耐盐基因CcSOS1在提高菊花抗盐性方面的应用。一种提高菊花抗盐性的方法，该方法包括如下步骤(1)构建CcSOS1基因的植物表达载体；(2)采用农杆菌介导法将含CcSOS1基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。本发明从盐生植物大岛野路菊首次克隆了一个新的耐盐基因CcSOS1，通过将该基因整合到菊花基因组中，通过高盐试验分析获得耐高盐的转基因菊花株系。利用本方法可以显著提高菊花的耐盐性。
文档编号C12N15/29GK102559702SQ201210063040
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘兆磊, 卢军刚, 安娟, 宋爱萍, 房伟民, 管志勇, 蒋甲福, 陈发棣, 陈素梅 申请人:南京农业大学