人乳头瘤病毒l1l2衣壳蛋白相互作用位点及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子病毒学领域。具体地，本发明涉及人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1与次要衣壳蛋白L2相互作用的结合位点。所述蛋白结合位点及区域可用于作为预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌等的靶位点。本发明还涉及HPV突变型L1蛋白。本发明还涉及一种药物组合物以及所述药物组合物用于制备治疗和/预防和/辅助治疗HPV感染或者由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌等的用途。
CCTCC NO:C201268
2012.05.31
【专利说明】人乳头瘤病毒L1L2衣壳蛋白相互作用位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子病毒学领域。具体地，本发明涉及人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1 与次要衣壳蛋白L2相互作用的结合位点。所述蛋白结合位点可用于作为预防HPV感染及 由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌等的靶位点。本发明还涉及HPV突变型L1蛋白。本 发明还涉及一种药物组合物以及所述药物组合物用于制备治疗和/预防和/辅助治疗HPV 感染或者由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌等的用途。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)属于乳头瘤病毒科 (Papillomaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因组为双链闭环DNA，大 小约为7. 2 - 8kb，具有8个开放阅读框。HPV病毒颗粒直径为45 - 55nm，核衣壳呈20面 体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。目前已经发现的100多种型的HPV中，根据其 与肿瘤发生的关系可以分为两类：低危型一包括HPV6和HPV11，致癌风险低，主要引起尖锐 湿疣；高危型一包括即￥16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，是导致包括女性宫颈癌在内 的多种肿瘤疾病的主要原因 （Clifford GM，Smith JS，Plummer M, et al. Br J Cancer, 2003, 88(1) :63-73)。
[0003] HPV LI蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55 - 60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多 种表达系统中表达的HPV L1蛋白可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒 (Virus-Like Particle, VLP)。该病毒样颗粒保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫 原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体（Kirnbauer，R.，F. Booy，et al. 1992Proc Natl Acad SciUSA89(24): 12180-4)。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。目前已 上市的hpv疫苗为Merck的Gai>das ￡ 1?及gsk的Cervar iX? ,上述两种疫苗分别含有 HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP。此外，现有的研究结果表明，可以通过预防HPV感染来预 防宫颈癌等疾病的发生。
[0004] 研究表明，HPV L2约有473个氨基酸，分子量约为51KD，目前L2蛋白结构尚未解 析。研究发现L2的N端和C端都有一段富含正电荷的氨基酸区域以及C端有一入核信号 肤，在病毒 DNA 核定位中有重要作用（Day PM.，Gambhira R.，Roden RB.，et al. Mechanisms of human papillomavirus typel6neutralization by 12cross_neutralizing and lltype-specific antibodies.J Virol. 2008May ；82(9):4638-46. Epub2008Feb27.)〇 L2 在病毒感染初期的免疫逃逸、入侵宿主细胞、病毒DNA的核定位及病毒颗粒的高效组装等 过程中均具有重要作用（Fahey LM.，Raff AB.，Da Silva DM. A major role for the minor capsid protein of human papillomavirus typel6in immune escape J Immunol. 2009Novl5 ； 183 (10) : 6151-6. Epub20090ct28)。随着研究的深入，人们逐渐对HPV的入胞和致癌机制等 均有一定的认识，但天然HPV颗粒的组装机制及其成熟释放的过程及HPVL1与L2相互作用 尚未完全清楚。目前，HPV16L2与L1相互作用位点的研究仅有报道L2通过其C端396-439 位附近的氨基酸与L1疏水相互作用插入到五聚体背面的空洞中，仅有一小段暴露在表面 (Finnen RL, Erickson KD, Chen XS, et al, Interactions between papillomavirus LI and L2capsid proteins. J Virol. 2003Apr ;77 (8) :4818-26)。然而这些研究缺乏实验数据的支 持，且描述的L1和L2的作用区域过于宽泛，应用价值有限。
[0005] 因此，研究HPV的衣壳组装和HPVL1与L2相互作用对HPV预防性和治疗性疫苗设 计及HPV与宫颈癌之间的致病研究具有重要指导意义。
【发明内容】
[0006] 本发明人经过深入地研究和创造性的劳动，得到了位于HPV L1蛋白上的4个氨基 酸位点。本发明人惊奇地发现，这4个氨基酸位点是L1蛋白与L2蛋白相互作用的位点。通 过筛选抑制这些作用位点的药物，能够得到抑制HPV特别是HPV16以及治疗和/或预防和 /辅助治疗宫颈癌的药物。由此提供了下述发明：
[0007] 本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列为：SEQID N0 :1中的第 256、315、317、340位中的任意一个或者任意几个位点（例如2、3或4个）发生突变、替换 或缺失；具体地，所述4个位点中的任意一个或者任意几个（例如2、3或4个）位点突变为 丙氨酸；更具体地，为 SEQ IDN0 :9、SEQ IDN0 :19、SEQ IDN0 :20 或 SEQ IDN0 :21 所示的序列。 具体地，所述分离的多肽为HPV突变型L1蛋白。
[0008] 本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明的分离的多肽；具体 地，所述多核苷酸的序列如 SEQ IDN0 :33、SEQ IDN0 :43、SEQ IDN0 :44 或 SEQ IDN0 :45 所示。
[0009] 本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有一个或多个相同或不同的本发明的 多核苷酸；具体地，所述重组载体为重组pAAV或重组pT0-T7。
[0010] 本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体；具体地，所 述重组细胞为重组大肠杆菌细胞。
[0011] 本发明的再一方面涉及一种融合蛋白，其含有一个或多个相同或不同的本发明的 分离的多肽。
[0012] 本发明的再一方面涉及一种假病毒，其含有本发明的重组载体；具体地，所述假病 毒为HPV假病毒；更具体地，所述假病毒为HPV16假病毒。
[0013] 本发明的再一方面涉及一种病毒样颗粒（VLPs)，其含有本发明的多肽或者本发明 的融合蛋白。
[0014] 本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一个或多个相同或不同的本发明的多 肽或者本发明的融合蛋白；具体地，所述组合物，其还包含HPV野生型L1蛋白和/或HPV野 生型L2蛋白；具体地，所述HPV野生型L1蛋白为HPV16野生型L1蛋白；具体地，所述HPV 野生型L2蛋白为HPV16野生型L2蛋白。
[0015] 本发明的实施例证明，野生型HPV16L1的第256、315、317或340位点突变后，L1和 L2不能正常相互作用组成衣壳。本发明涉及的相互作用位点可以用于筛选与HPVL1相结合 的药物，进而可以抑制或阻断HPVL1&L2在人体细胞中的颗粒组装，达到抑制感染HPV的病 人体内的HPV持续感染，从而可以控制或治疗HPV感染引起的疾病如宫颈癌。本发明的多 肽或者融合蛋白可以作为阴性对照。
[0016] 本发明的再一方面涉及本发明的组合物在筛选抑制HPV的药物或者治疗和/或预 防和/辅助治疗HPV所致疾病例如宫颈癌的药物中的用途；具体地，所述HPV为HPV16 ;具 体地，所述宫颈癌为HPV16所致宫颈癌。
[0017] 本发明的再一方面涉及一种筛选抑制HPV的药物或者治疗和/或预防和/辅助治 疗HPV所致疾病例如宫颈癌的药物的方法，包括使用本发明的组合物的步骤；具体地，所述 HPV为HPV16 ;具体地，所述宫颈癌为HPV16所致宫颈癌。
[0018] 本发明的再一方面涉及本发明的多肽、多核苷酸、重组载体、重组细胞、融合蛋白、 假病毒或者病毒样颗粒在制备抑制HPV的药物或者治疗和/或预防和/辅助治疗HPV所致 疾病例如宫颈癌的药物（例如宫颈癌疫苗）中的用途。
[0019] 本发明的实施例证明，野生型HPV16L1的第256、315、317或340位点突变后，这4 个点突变蛋白的这12个抗原表位均未发生显著变化，位点突变后仍能保持与原野生型相 同的构象。
[0020] 本发明中相关术语的说明及解释
[0021] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验 室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供 相关术语的定义和解释。
[0022] 根据本发明，术语"HPVL1"是指人乳头瘤病毒（HPV)的L1蛋白，其序列是本领域 公知的（参见，例如NCBI数据库序列号：DQ469930. 1)。在本发明中，当涉及HPV L1的序列 时，如果没有特别说明，参考 Chen, X. S.，Garcea, R. L.，and Harrison, S. C. et al. 2000. Mol Cell, 5(3) :557-567.其使用 NCBI 数据库序列号：DQ469930. 1(SEQ ID NO :1)进行描述。
[0023] 本发明中"野生型HPV LI" 一词指的是，利用原核表达系统表达，纯化而制备的野 生型HPVL1蛋白。
[0024] 根据本发明，术语"HPV L1突变蛋白"是指，在L1蛋白中的某一位或某几位氨基酸 残基进行缺失或用其它氨基酸残基置换所获得的蛋白质。
[0025] 根据本发明，术语"HPVX Y Z"是指，用Z氨基酸残基的置换HPV型L1蛋白质N末 端的第Y位的X氨基酸残基所获得的蛋白质。如"HPV-F256A"指用丙氨酸（A)残基置换 HPVL1蛋白质N末端的第256位的半胱氨酸（F)残基所获得的蛋白质。
[0026] 根据本发明，术语"HPVL2"是指人乳头瘤病毒（HPV)的L2蛋白，其序列是本领域 公知的（参见，例如NCBI数据库序列号：CAC51368. 1)。在本发明中，当涉及HPV L2的序列 时，如果没有特别说明，参考 Ramon Pereira，Inga I. Hitzeroth，Edward P. Rybicki. 2009. Arch Virol, 154:187-197.其使用 NCBI 数据库序列号：CAC51368. 1 (SEQ ID NO :97)进行描 述。
[0027] 本发明中的术语"SAS"是指，利用Discovery Studio软件分析蛋白质的溶剂可及 化表面积（solvent accessibility surfaces, SAS)。SAS表示氨基酸可以接触到溶剂的表 面积占整个氨基酸表面积的比例，是反映氨基酸暴露程度的一个指标，其值越大表明该氨 基酸暴露在蛋白质结构表面的程度越高。
[0028] 本发明中"载体"一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获 得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质 元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色 体如酵母人工染色体（YAC)、细菌人工染色体（BAC)或P1来源的人工染色体（PAC);噬菌体 如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒（包括 慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病 毒、乳头多瘤空泡病毒（如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序 列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。 载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只 有这些物质。
[0029] 本发明中的"单抗"一词指的是由杂交瘤细胞分泌的单抗。单抗对抗原上的单一表 位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。如， 本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得（Nature, 256:495, 1975)
[0030] 本发明中"抗体滴度"一词指的是，利用间接法ELISA检测抗原与抗体的结合水 平，以反应呈阳性的最高的抗体稀释度表示，反应滴度越高，则抗原与抗体的结合越强。若 抗体与几个抗原的反应滴度相当，则说明这几个抗原的该抗体表位的结构是相似的。
[0031] 本发明中的假病毒指利用HPV VLP可非特异性包装核酸的特性，通过在细胞内表 达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，组成 HPV 假病毒（Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570 - 7)。具体方法 包括重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。
[0032] 本发明中的野生型假病毒指在细胞内表达野生型的L1和L2蛋白，通过包裹细胞 内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，组成HPV假病毒。
[0033] 本发明中的HPV突变假病毒是指在假病毒的L1或L2基因序列中进行定点突变， 而后使用与制备假病毒同样的方法进行制备。如
[0034] 本发明中的TCID5(I是指，半数组织培养感染剂量（Tissue culture infective dose，TCID5(I)，又称50%组织细胞感染量，反映感染性滴度，即指能在半数细胞培养板或孔 内引起细胞病变的病毒量。
[0035] 感染滴度，反映病毒的感染能力，用TCID5(l/ml来表示，即每毫升病毒溶液稀释多 少倍之后仍具有能在半数细胞培养板或孔内引起细胞病变的病毒量。因此，数值越高，感染 能力越强。
[0036] 本发明提供了一种双抗体夹心酶联免疫吸附方法（Sandwich ELISA)检测假病毒 中衣壳蛋白L1含量的方法。
[0037] 本发明还提供了一种蛋白免疫印迹方法（Westren-blot)检测假病毒中衣壳蛋白 L2方法。
[0038] 本发明还提供了一种免疫共沉淀方法（Co-IP)检测假病毒中衣壳蛋白L1和L2相 互作用的方法。
[0039] "序列相同百分比"一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸 或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有 关的术语"序列相似百分比"定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序 列或氨基酸序列的相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳 过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本 领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂 得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法则达到而全长序列的 比较。
[0040] 发明的有益效果
[0041] 与现有技术相比，本发明提供的主要衣壳蛋白L1与次要衣壳蛋白L2相互作用的 结合位点具有显著的有利方面。特别地，本发明的结合位点能够阻断L1和L2蛋白形成HPV 衣壳，从而使其在病毒的预防与治疗方面具有特别显著的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1 :pAAV-HPV16L123个突变载体构建过程中的PCR扩增鉴定结果。泳道样 品顺序如下：泳道1 :pAAV-H16Ll-E106A质粒；泳道2 :pAAV-H16Ll-F248A质粒；泳道3 : PAAV-H16L1-Y249A 质粒；泳道 4 :pAAV-H16Ll-L250A 质粒；泳道 5 :pAAV-H16Ll-R251A 质粒；泳道 6 :pAAV-H16Ll-R252A 质粒；泳道 7 :pAAV-H16Ll-Q254A 质粒；泳道 8 : PAAV-H16L1-F256A 质粒；泳道 9 :pAAV-H16Ll-S298A 质粒；泳道 10 :pAAV-H16Ll-M299A 质粒；泳道 11 :pAAV-H16Ll-T301A 质粒；泳道 12 :pAAV-H16Ll-D303A 质粒；泳道 13 : PAAV-H16L1-N308A 质粒；泳道 14 :pAAV-H16Ll-K309A 质粒；泳道 15 :pAAV-H16Ll-P310A 质粒；泳道 16 :pAAV-H16Ll-W312A 质粒；泳道 17 :pAAV-H16Ll-Q314A 质粒；泳道 18 : PAAV-H16L1-R315A 质粒；泳道 19 :pAAV-H16Ll-Q317A 质粒；泳道 20 :pAAV-H16Ll-T340A 质粒；泳道 21 :pAAV-H16Ll-K467A 质粒；泳道 22 :pAAV-H16Ll-L470A 质粒；泳道 23 : PAAV-H16L1-Q471A质粒。结果显示，成功地构建了 23个pAAV-HPV16Ll突变质粒。
[0043] 图2 :pAAV_16Ll突变载体质粒酶切结果。泳道样品顺序如下：泳道1 : PAAV-H16L1-E106A 质粒；泳道 2 :pAAV-H16Ll-F248A 质粒；泳道 3 :pAAV-H16Ll-Y249A 质粒；泳道 4 :pAAV-H16Ll-L250A 质粒；泳道 5 :pAAV-H16Ll-R251A 质粒；泳道 6 : PAAV-H16L1-R252A 质粒；泳道 7 :pAAV-H16Ll-Q254A 质粒；泳道 8 :pAAV-H16Ll-F256A 质粒；泳道 9 :pAAV-H16Ll-S298A 质粒；泳道 10 :pAAV-H16Ll-M299A 质粒；泳道 11 : PAAV-H16L1-T301A 质粒；泳道 12 :pAAV-H16Ll-D303A 质粒；泳道 13 :pAAV-H16Ll-N308A 质粒；泳道 14 :pAAV-H16Ll-K309A 质粒；泳道 15 :pAAV-H16Ll-P310A 质粒；泳道 16 : PAAV-H16L1-W312A 质粒；泳道 17 :pAAV-H16Ll-Q314A 质粒；泳道 18 :pAAV-H16Ll-R315A 质粒；泳道 19 :pAAV-H16Ll-Q317A 质粒；泳道 20 :pAAV-H16Ll-T340A 质粒；泳道 21 : PAAV-H16L1-K467A 质粒；泳道 22 :pAAV-H16Ll-L470A 质粒；泳道 23 :pAAV-H16Ll-Q471A 质 粒。结果显示，成功地构建了 23个pAAV-HPV16Ll突变基因。
[0044] 图3 :蛋白质印迹对各突变假病毒的L1和L2蛋白量的检测结果。泳道1 :L1蛋白； 泳道2 :L2蛋白；泳道3 :E106A突变假病毒；泳道4 :F248A突变假病毒；泳道5 :Y249A突变 假病毒；泳道6 :L250A突变假病毒；泳道7 :R251A突变假病毒；泳道8 :R252A突变假病毒； 泳道9 :Q254A突变假病毒；泳道10 :F256A突变假病毒；泳道11 :S298A突变假病毒；泳道 12 :M299A突变假病毒；泳道13 :T301A突变假病毒；泳道14 :D303A突变假病毒；泳道15 : N308A突变假病毒；泳道16 :K309A突变假病毒；泳道17 :P310A突变假病毒；泳道18 :W312A 突变假病毒；泳道19 :Q314A突变假病毒；泳道20 :R315A突变假病毒；泳道21 :Q317A突变 假病毒；泳道22 :T340A突变假病毒；泳道23 :K467A突变假病毒；泳道24 :L470A突变假病 毒；泳道25 :Q471A突变假病毒；泳道26 :HPV16野生型假病毒。结果显示，除E106A、N308A 和W312A突变后未表达L1蛋白外，其余均正常表达。
[0045] 图4 :使用双抗体夹心ELISA法测定不同L1突变构建的突变假病毒以及野生型 HPV16假病毒中L1含量测定结果。wt，wildtype，野生型HPV16假病毒，Llalone，野生型 HPV16L1但无 L2的假病毒。结果显示，除了 E106A、N308A和W312A突变后未表达L1蛋白 夕卜，其余均正常表达。
[0046] 图5 :6个纯化后的HPV16L1突变蛋白以及野生型HPV16L1蛋白SDS-PAGE结果。其 中 1 为野生型 HPV16L1，2 为 HPV16L1-F256A，3 为 HPV16L1-R315A，4 为 HPV16L1-Q317A，5 为 HPV16L1-T340A，6 为 HPV16L1-R251A，7 为 HPV16L1-T301A，8 为 HPV16L1 - K476A。SDS-PAGE 结果显示，4个HPV16L1突变蛋白纯化纯度均达到了 95%左右。
[0047] 图6 :使用透射电镜观察HPV16L1突变蛋白的结果。其中图6A为野生型HPV16L1， 图 6B 为 HPV16L1-F256A，图 6C 为 HPV16L1-R315A，图 6D 为 HPV16L1-Q317A，图 6E 为 HPV16L1-T340A，图 6F 为 HPV16L1 - R251A，图 6G 为 HPV16L1 - T301A，图 6H 为 HPV16L1 -K476A。结果显示，HPV16L1突变蛋白在电镜视野下均能观察到均一的直径约为50nm的颗粒， 表明这些位点突变后不影响VLP的形成。
[0048] 图 7 :通过间接法 ELISA 检测 HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、 HPV16L1-T340A以及野生型HPV16L1蛋白与HPV16抗体的反应性。检测结果表明， HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV16L1-T340A 蛋白与 HPV16 抗体的反应 滴度在105-107之间，与野生型HPV16L1与HPV16抗体的反应性相当。
[0049] 图8 :最低稀释度的不同突变L1构建的突变假病毒感染293FT细胞表达GFP在 荧光显微镜下的观察结果。A :野生型HPV16假病毒；B :单独L1形成的HPV16假病毒；C : 单独L2形成的HPV16假病毒；D :H16L1-E106A突变假病毒；E :H16L1-F248A突变假病毒； F :H16L1-Y249A突变假病毒；G :H16L1-L250A突变假病毒；H :H16L1-R251A突变假病毒；I : H16L1-R252A突变假病毒；J :H16L1-Q254A突变假病毒；K :H16L1-F256A突变假病毒；L : H16L1-S298A突变假病毒；M :H16L1-M299A突变假病毒；N :H16L1-T301A突变假病毒；0 : H16L1-D303A突变假病毒；P :H16L1-N308A突变假病毒；Q :H16L1-K309A突变假病毒；R : H16L1-P310A突变假病毒；S :H16L1-W312A突变假病毒；T :H16L1-Q314A突变假病毒；U : H16L1-R315A突变假病毒；V :H16L1-Q317A突变假病毒；W :H16L1-T340A突变假病毒；X : H16L1-K417A突变假病毒；Y :H16L1-L470A突变假病毒；Z :H16L1-Q371A突变假病毒。结 果显示，单独的L1蛋白形成的假病毒，单独L2形成的假病毒以及H16L1-E106A突变假病 毒，H16L1-N308A突变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒无法感染293FT细胞使报告基因 表达，而H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、H16L1-R317A突变假病毒和 H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显著降低。其余突变假病毒感染能力与野生型假病毒 相当。
[0050] 图9 :不同L1突变构建的突变假病毒的感染滴度结果。wt，Wildtype，野生型HPV16 假病毒；Llalone，野生型HPV16L1但无 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但无 L1的假 病毒。结果显示，单独的L1蛋白形成的假病毒，单独L2形成的假病毒以及H16L1-E106A突 变假病毒，H16L1-N308A突变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒无法感染293FT细胞使报 告基因表达，而H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、H16L1-R317A突变假病 毒和H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显著降低。其余突变假病毒感染能力与野生型假 病毒相当。
[0051] 图10 :1〇Α - 10C显示了不同突变L1构建的突变假病毒感染293FT细胞后，由流 式细胞仪检测其感染率的结果；图10D是突变假病毒感染率统计结果。wt，wildtype，野 生型HPV16假病毒；Llalone，野生型HPV16L1但无 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2 但无 L1的假病毒。结果显示了单独的L1蛋白形成的假病毒，单独L2形成的假病毒以及 H16L1-E106A突变假病毒，H16L1-N308A突变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒无法感 染293FT细胞使报告基因表达，而H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、 H16L1-R317A突变假病毒和H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显著降低。其余突变假病 毒感染能力与野生型假病毒相当。
[0052] 图11 :蛋白免疫印迹分析结果。Wt，wildtype，野生型HPV16假病毒；Llalone，野 生型HPV16L1但无 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但无 L1的假病毒；其余则为突 变假病毒；L1与L2分别指使用HPV16L1的单抗22E4以及HPVL2的单抗14H6对免疫共沉 淀的蛋白进行检测的结果。图11A显示14H6抗体捕获L2时，单独L2检测不到，野生型假 病毒中被免疫共沉淀下来的L1蛋白量比4个H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和 H16L1-T340A突变假病毒的L1多图；11B显示了野生型假病毒中被共沉淀的L2蛋白量较 H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A 和 H16L1-T340A 这 4 个突变假病毒多。
[0053] 关于生物材料保藏的说明
[0054] 本发明涉及以下生物材料：
[0055] 杂交瘤细胞HPV14H6,其于2012年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCCN0:C201268,保藏地址为中国.武汉.武汉大学，430072。
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0057] 除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上 参照J. Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989,以及 F. M. Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述 的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施 例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
[0058] 实施例1 :计算机分析预测HPV16L1与HPV16L2相互作用位点
[0059] 本实验室用于蛋白质结构分析与模拟的Discovery Studio软件购自美国 Accelrys公司。利用Discovery Studio软件分析HPVL1五聚体可能与L2相互作用的表面 氨基酸，通过氨基酸的溶剂可及化表面积（solvent accessibility surfaces, SAS)来评价。 SAS表示氨基酸可以接触到溶剂的表面积占整个氨基酸表面积的比例，是反映氨基酸暴露 程度的一个指标，其值越大表明该氨基酸暴露在蛋白质结构表面的程度越高（Le Grand，S. Μ. ,Eyrand,V. An algorithm for the representation and conputatio of suermolecular surface and volumes. J. Comp. Chen. 1989, 10:868-871)。其中，筛选出 23 个位点，其 SAS 在 15%以上，如表1。
[0060] 不拘于理论的限制，由于丙氨酸体积小、无其他官能团的甲基，同时对蛋白质结构 的影响较小，若换成侧链更小的甘氨酸，因其阿尔法-碳没有手性，可能对蛋白结构有较大 影口向(Morrison, K. L. &ffeiss, G. A. Combinatorial alanine-scanning[J]. Curr Opin Chem Biol, 2001，5:302-307)。故采用丙氨酸扫描法将这23个位点逐一突变成丙氨酸，，验证其 是否是与L2相互作用的位点。这23个突变的L1大蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0 : 2 - 24所不，其编码这些氨基酸序列的DNA序列分别如SEQ ID NO :26 - 48所不。
[0061] 表1 :计算机预测HPV16L1&L2可能相互作用位点（23个）
[0062]
[0063]
【权利要求】
1. 一种分离的多肽，其氨基酸序列为： SEQ ID NO :1中的第256、315、317、340位中的任意1个、2个、3个或4个位点发生突变、 替换或缺失；具体地，所述4个位点中的任意1个、2个、3个或4个位点突变为丙氨酸；更具 体地，为 SEQ IDN0 :9、SEQ IDN0 :19、SEQ IDN0 :20 或 SEQ IDN0 :21 所示的序列。
2. -种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的分离的多肽；具体地，所述多核苷酸 的核酸序列如 SEQ IDN0 :33、SEQ IDN0 :43、SEQ IDN0 :44 或 SEQ IDN0 :45 所示。
3. -种重组载体，其含有一个或多个相同或不同的权利要求2所述的多核苷酸；具体 地，所述重组载体为重组pAAV或重组pT0-T7。
4. 一种重组宿主细胞，其含有权利要求3所述的重组载体；具体地，所述重组细胞为重 组大肠杆菌细胞。
5. -种融合蛋白，其含有一个或多个相同或不同的权利要求1所述的分离的多肽。
6. -种假病毒，其含有权利要求3所述的重组载体；具体地，所述假病毒为HPV假病 毒；更具体地，所述假病毒为HPV16假病毒。
7. -种病毒样颗粒，其含有权利要求1所述的多肽或者权利要求5所述的融合蛋白。
8. -种组合物，其包含一个或多个相同或不同的权利要求1所述的多肽或者权利要求 5所述的融合蛋白；具体地，所述组合物，其还包含HPV野生型L1蛋白和/或HPV野生型L2 蛋白；具体地，所述HPV野生型L1蛋白为HPV16野生型L1蛋白；具体地，所述HPV野生型 L2蛋白为HPV16野生型L2蛋白。
9. 权利要求8所述的组合物在筛选抑制HPV的药物或者治疗和/或预防和/辅助治疗 HPV所致疾病例如宫颈癌的药物中的用途；具体地，所述HPV为HPV16 ;具体地，所述宫颈癌 为HPV16所致宫颈癌。
10. -种筛选抑制HPV的药物或者治疗和/或预防和/辅助治疗HPV所致疾病例如宫 颈癌的药物的方法，包括使用权利要求8的组合物的步骤；具体地，所述HPV为HPV16 ;具体 地，所述宫颈癌为HPV16所致宫颈癌。
11. 权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体、 权利要求4所述的重组细胞、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的假病毒或者权 利要求7所述的病毒样颗粒在制备抑制HPV的药物或者治疗和/或预防和/辅助治疗HPV 所致疾病例如宫颈癌的药物（例如宫颈癌疫苗）中的用途。
【文档编号】G01N33/68GK104231060SQ201410234629
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2013年6月5日
【发明者】李少伟, 吴坤宝, 张丽, 刘亚静, 王大宁, 俞海, 张军, 夏宁邵 申请人:厦门大学, 厦门万泰沧海生物技术有限公司