专利名称：环介导恒温扩增技术快速检测微小亚历山大藻的方法
技术领域：
本发明属微小亚历山大藻的DNA分子检测领域，特别是涉及一种环介导恒温扩增 技术快速检测微小亚历山大藻的方法。
背景技术：
微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)是中国海域多发赤潮藻，能够产生麻痹 性贝毒，近年来引发多起赤潮。目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些 方法从分子水平解决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反 应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许 多学者通过微藻某些基因片段扩增来对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析， 核糖体间隔区(ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定。荧光原位杂交也 是近年来微藻鉴定的检测手段，有些学者利用核糖体大亚基(LSU)和ITS区分子探针对某 些赤潮微藻进行了鉴定，但是这种技术对探针要求高。实时荧光定量PCR检测也是近年来 微藻检测一个方向，这种方法非常灵敏，检测时间需1 2小时，但是所需实验仪器(荧光 定量PCR仪)和试剂价格昂贵。上述方法因为实验条件等因素限制不能应用于现场检测。2000年，日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导恒温 扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个 区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65°C 左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度 循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察 核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速 判定。这种技术已经广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。但迄今为止，尚 未见将该技术应用于微小亚历山大藻检测鉴别的相关文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种环介导恒温扩增技术快速检测微小亚历 山大藻的方法，该方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判 定简单等优点，适合对微小亚历山大藻快速鉴定和现场检测。本发明的一种环介导恒温扩增技术快速检微小亚历山大藻的方法，包括(1)赤潮藻类的基因组DNA提取(2) LAMP 扩增引物 (3) LAMP扩增反应体系(4) LAMP扩增产物的检测。所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为2. 5uL 10 Xbuffer (内 含2mM的MgS04)，2个内引物Am-FIP和Am-BIP的终浓度均为1. 6 μ M，两个外引 物Am-F3和Am-B3的终浓度均为0. 2 μ M，此外还包括6mM MgS04,0. 6mM dNTP, 0. 6M Betaine (Sigma-Aldrich), 8U Bst DNA 聚合酶，IuL DNA 模板(50ng)；所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为反应温度65°C，反应时间60min， 最后于85°C保持3min终止反应；所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，反应管内可见到大量白色沉淀产生则呈阳 性；或加2yL 100 X SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变 为阴性。有益效果本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速(1小时内即可完成检测)、对仪器要求 不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小亚历山大藻快速鉴定和检 测，有望应用到赤潮现场快速检测领域。
图1为微小亚历山大藻LAMP检测电泳图；图2为微小亚历山大藻LAMP检测SYBR Green I染色图；其中，1.2.两株微小亚历山大藻，3.链状亚历山大藻，4.赤潮异湾藻，5.卡氏前沟 藻，6.利玛原甲藻，7.角毛藻，8.微小原甲藻，9.环状异帽藻。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1微小亚历山大藻LAMP扩增弓丨物的设计(1)微小亚历山大藻的基因组DNA提取
把培养至对数期的微小亚历山大藻细胞液分装至2ml离心管，离心，倒掉上清，力口 入 600μ L 提取液(100mm。l/L Tris-Hcl, 1 OOmmo 1/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl,2% CTAB,2% 3-巯基乙醇)，651水浴111。加入等体积PCI抽提液(体积比，苯酚氯仿异戊醇= 25 24 1)，混勻，在4°C、12500rpm条件下离心lOmin。转移上清液至新离心管中，加入 RNase 至终浓度为 1 μ g/mL，37°C放置 30min。PCI 重复抽提一次，4°C，12500rpm 离心 lOmin。 水相转移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在 4°C，12500rpm，离心20min。弃上清液，70%乙醇洗涤DNA沉淀。DNA溶于无菌水，待用。(2)PCR扩增引物设计及扩增后目标基因序列的获得将步骤(1)提取到的微小亚历山大藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，以核 糖体DNA转录单元内间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)为目标基因序列；扩增引物为LH2:5，AGGTGAACCTGCGGAAGGATC3，；D1am 5，CCTGCAGTCGACA (TG)ATGCTTAA (AG)TTCAGC (AG)GG3，；分别对应于18S rDNA3，末端和24S rDNA 5，末端区域；扩增体系反应总体系为50yL，其中包括5yL IOXPCR反应缓冲液，4μ L MgCl2 (25mmol/L)，O. 4 μ L TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)，2 μ L dNTP (2. 5mml/L)，2 μ L 基因组 DNA (50 μ g/mL)，加 ddH20 补足体积；扩增后的目的基因序列TCTAATGTTGCATGACTTTGTGAGCTGTGGTGGGGTTCCTTGGCTTTAGGTTCTTCATCATTTGCTCGT GGGTGGCATGGCTTGCCTCGGCAAGCGCTTTCATGCTGCTGTGCGTTTGTCCTGTGACTGACTCTTTACCATTTTGT TGTTTACTTGTATCCATTGTGTGAAATGTGTTTTTGCAATGAATGTCTTAGCTCAATTGATGATGAAGAATGCAGCA AAATGTGATATGCATTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAGCCAATAGATGTTTGAACGTGATTTGCACCTTCGGGATAT GCTTGAAGGTGTGCTTGATTCAATGTCAATTATTTTCCAACCTTCCCTTGCTGTGTAGCAATGTTGTGAGCTGTGTG TGTCAATGCTGTAGCATTGGACACCCGCGCTTACGAATGCATTGCAACCTTGCTGTGTCTGCTTAGGTCTAACCTCT GTCACTTGCCTTGGTTGCAATGTGTTTGGGCATGTAGCTGAACAGCGTAAACTTAACATGAAGTGAAGCATGTAAAC CCGCTGAATTTAAGCATATGTCGACTGCAGGA ；(3) LAMP扩增弓丨物设计对上述测定的序列进行Blast分析后，找到转录单元内间隔区ITSl和ITS2，分别 以ITSl和ITS2区为靶序列设计引物，用Primer Explorer V4设计引物 实施例2微小亚历山大藻与阴性对照实验(1)赤潮藻类的基因组DNA提取共包括8种藻类的DNA提取2株微小亚历山大藻(Prorocentrum minimum)，链状 亚历山大藻(Alexandrium catenella)，赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)，卡氏前沟藻 (Amphidinium carterae),利玛原甲藻(Prorocentrum lima),角毛藻(Chaetoceros sp.), 微小原甲藻(Prorocentrum minimum)，环状异巾冒藻(Heterocapsa circularisquama)，具体 步骤如下把培养至对数期的10种藻细胞液分装至2mL离心管，离心，倒掉上清，加入600 μ L 提取液(100mmol/L Tris-Hcl, 1 OOmmo 1/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl,2% CTAB,2% β-巯基乙 醇)，65°C水浴lh。加入等体积PCI抽提液(体积比，苯酚氯仿异戊醇=25 24 1)， 混勻，在4°C、12500rpm条件下离心lOmin。转移上清液至新离心管中，加入RNase至终浓度 为1 μ g/mL，37°C放置30min。PCI重复抽提一次，4°C，12500rpm离心lOmin。水相转移至新 离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在4°C，12500rpm， 离心20min。弃上清液，70%乙醇洗涤DNA沉淀。DNA溶于无菌水，用于LAMP扩增。(2) LAMP 扩增引物 (3) LAMP扩增反应体系LAMP 扩增反应体系为 25uL，包括2· 5uL IOXbuffer (内含 2mM of MgS04)，2 个 内引物Am-FIP和Am-BIP的浓度均为1. 6 μ mol/L，两个外引物Am_F3和Am_B3的浓度均为 0. 2ymol/L,6mmol/L MgS04,0. 6mmol/L dNTP，0. 6mol/L Betaine (Sigma-Aldrich), 8U Bst DNA聚合酶，IuL DNA模板，反应温度为65°C，反应时间为60min，最后85°C，3min终止反应；(4) LAMP扩增产物的检测a. LAMP产物特异性扩增的确认取2μ L反应后的LAMP产物于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察， 可见只有两株微小亚历山大藻出现梯状条带，其他微藻没有扩增条带(见图1)；b.由于LAMP反应产生白色焦磷酸镁沉淀，可肉眼直接观察，在本方法中阳性反应 管内可见到大量白色沉淀产生；或加2μ L 100XSYBR Green I于反应管中，阳性反应管呈 现绿色，而阴性反应管内颜色不变(见图2)。
权利要求
一种环介导恒温扩增技术快速检微小亚历山大藻的方法，包括(1)赤潮藻类的基因组DNA提取(2)LAMP扩增引物两个外引物Am-F3CTTTGTGAGCTGTGGTGG；Am-B3TTCTTCATCATCAATTGAGCTAA；两个内引物Am-FIPCAGCAGCATGAAAGCGCTTG-GTTCTTCATCATTTGCTCGTG；Am-BIPCGTTTGTCCTGTGACTGACTC-GACATTCATTGCAAAAACACATT；(3)LAMP扩增反应体系(4)LAMP扩增产物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小亚历山大藻的方法， 其特征在于所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为2. 5uL 10 Xbuffer，两个 内引物Am-FIP和Am-BIP的终浓度均为1. 6 μ Μ，两个外引物Am_F3和Am_B3的终浓度均为 0. 2μΜ，另外还包括 6mM MgS04,0. 6mM dNTP，0.6M Betaine (Sigma-Aldrich), 8U Bst DNA 聚合酶，IuL DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小亚历山大藻的方法， 其特征在于所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为反应温度65°C，反应时间 60min，最后于85°C保持3min终止反应。
4.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小亚历山大藻的方法， 其特征在于所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，电泳检测可见阳性反应出现梯状条 带，阴性反应没有条带的出现，肉眼观察可见阳性反应管内有大量白色沉淀产生；或加 2 μ LlOOX SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测微小亚历山大藻的方法，包括(1)赤潮藻类的基因组DNA提取；(2)4条LAMP扩增引物Am-F3CTTTGTGAGCTGTGGTGG；Am-B3TTCTTCATCATCAATTGAGCTAA；Am-FIPCAGCAGCATGAAAGCGCTTGGTTCTTCATCATTTGCTCGTG；Am-BIPCGTTTGTCCTGTGACTGACTC-GACATTCATTGCAAAAACACATT；(3)LAMP扩增反应体系；(4)LAMP扩增产物的检测。本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小亚历山大藻快速鉴定和检测。
文档编号C12Q1/68GK101838690SQ20101010211
公开日2010年9月22日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者张凤英, 石彦红, 蒋科技, 马凌波, 马春艳 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所