用于实时荧光定量pcr方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物组及监测方法
【技术领域】 [0001] 的
[0002] 本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于实时荧光定量PCR方法监测链 状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物组及监测方法。
【背景技术】
[0003] 赤潮作为一种生态现象，由于对环境、水产养殖业、渔业、旅游业和人类健康的严 重影响而受到广泛重视，赤潮已成为全球环境问题热点之一。近十几年来，由于海洋污染日 益加剧，我国赤潮灾害也有加重的趋势，由分散的少数海域，发展到成片海域，一些重要的 养殖基地受害尤重。
[0004] 2000年我国海域共记录到赤潮28起，比1999年增加了 13起，累计面积1万多平 方公里。其中，东海发现11起，累计面积达7800多平方公里；渤海发现7起，累计面积近 2000平方公里，黄海发现4起，累计面积800多平方公里；南海发现6起，但累计面积不到 50平方公里。
[0005] 2003年，全海域共发生100平方公里以上的赤潮27次。其中，500平方公里以上 的赤潮8次，东海赤潮发生次数和累计面积分别约占全海域的72%和89%。
[0006] 2006年，全海域赤潮发生次数较上年增加，全年共发现赤潮93次，较2005年增加 约13% ;赤潮累计发生面积约19840平方公里，较2005年减少约27%。其中，在赤潮监控 区内发现赤潮46次，累计面积约11590平方公里，分别约占全海域赤潮累计发生次数和面 积的49%和58%。全海域共发生100平方公里以上的赤潮31次，累计面积18540平方公 里，分别占赤潮发生次数和累计面积的33%和93% ;其中，面积超过1000平方公里的赤潮 为7次，较上年减少2次，累计面积减少51 %。赤潮高发区集中在东海海域，赤潮发生次数 和累计发生面积分别占全海域的68%和76%。
[0007] 为将赤潮危害降至最低，赤潮的监测预报必不可少，除了海洋物理学耗资巨大的 卫星遥感与飞行监测，生物学的监测方法主要有依赖形态学检测的光学显微镜观察和图像 识别系统、免疫学及核酸、lectin探针检测技术等。这些方法主要是通过赤潮藻细胞数目 的增减判断赤潮爆发的可能性，而一旦细胞达到一定的数目，赤潮已经发生，即实际上达不 到预报的目的，真正的预报应可以"推测"赤潮未来发生的可能性。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于实时荧光定量PCR 方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物组及监测方法。
[0009] 本发明的技术方案是：
[0010] -种用于实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物，所 述引物的序列如MT-Q-S和MT-Q-A所示。
[0011] 一种使用实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的方法，使 用荧光定量PCR分析mt基因差异表达，以cob和18SRNA为内参基因，以双内参基因的Ct值来校准目的基因mt相对表达量，采用2AACT法进行数据的分析，AACT=(CT^t-CT内参基 因）实验-(CTnit-CT内参綱）对照；当2 aact^ 2时，链状亚历山大藻细胞将进入爆发性生长 状态；当2 AACT< 2时，链状亚历山大藻细胞未进入爆发性生长状态。
[0012] 所述内参基因为：cob和18SRNA。
[0013] 所述内参基因的引物为：
[0014] cob-S：TTTTCTTCAAACTCATTTCGGGAT；
[0015] cob-A：TGGGCACAGCTTTTAACATAGCATA；
[0016] 18SrRNA-S：GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGA；
[0017] 18SrRNA-A：CAAATCACTCCACCAACTAAGAACGG〇
[0018] -种使用实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的方法，具 体步骤如下：
[0019] (1)采用滤膜过滤法从目标海域收集链状亚历山大藻IO3~10 6个，将收集的藻细 胞置于3L三角瓶的2L海水中，遮光布黑暗48小时进行同步化处理，每隔2小时晃动一次， 然后进行实验室培养，培养温度为20±1°C，光照强度30001x，光暗周期12h光照/12h黑 暗，培养基为检测海域过滤消毒海水，培养至第二天为生长周期的延迟期，作为对照组；实 验组为继续在海域中生长的藻细胞；采用滤膜过滤法分别从对照组和实验组收集藻细胞， 分别作为对照组和实验组，进行实验测定。
[0020] ⑵RNA提取；
[0021] (3)反转录合成的cDNA:
[0022] (4)qPCR：
[0023] 利用对照组与实验组的反转录cDNA，进行qPCR反应；
[0024] qPCR反应体系如下：
[0025]
[0027] 荧光实时定量PCR的反应条件如下：
[0028] 第一步，5(TC，2min;
[0029] 第二步，95°C，2min;
[0030] 第三步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 个循环；
[0031] 第四步，做熔解曲线：95°C，15sec;60°C，Imin;95°C，15sec;60°C，15sec;
[0032]荧光信号的采集设置在第三步后；收集每个重复的mt基因Ct值，内参基因的Ct 值，两个内参基因Ct值取几何平均值；
[0033] (5)基因相对表达量分析
[0034] 采用2AACT的相对定量方法对基因的相对表达量进行分析；AACT=(CT^t-CT内 参基因）实验-(CTnit-CT内参綱）对照；
[0035] 2aactS2,链状亚历山大藻细胞将进入爆发性生长状态；
[0036] 当2AACT < 2时，链状亚历山大藻细胞未进入爆发性生长状态。
[0037] 本发明的优势在于：1、灵敏度高、特异性和可靠性强。在藻细胞生长的对数期即能 够完成检测，可在链状亚历山大藻细胞富集量最大之前采取措施，减少危害，实现对赤潮真 正的预警预报。2、自动化程度高，无污染。整个实验过程在实验室进行，没有外排污染物。 3、具有实时和准确的特点。能够从分子水平检测链状亚历山大藻细胞的生长阶段，以小见 大，从最大程度上减少了赤潮预测的误差性。4、费用较低。实验过程是基于ABI7500荧光 定量PCR仪，没有露天大规模设施，降低了实验经费。5、实验操作简单，具有可推广性。
【具体实施方式】
[0038] 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁 克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件来进行操作。
[0039] mt基因在我们检测的所有爆发性生长条件下均表现表达量升高，表明其与细胞生 长的相关性和一致性。cob和18SrRNA是广泛用于荧光定量PCR的内参基因，并且同时使 用两个内参基因在一定程度上消除了由于内参基因不稳定所造成的误差。
[0040] 使用Primer5. 0对引物进行设计，引物设计遵守以下原则：引物设计原则：产物 长度75bp-200bp，避免二级结构，GC含量45 % -55 %，引物长度20-25bp，Tm值在58-62 °C。 引物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。
[0041] 实施例1
[0042] (1)实验材料的培养与收集：
[0043] 将生长在中氮中磷培养基中的链状亚历山大藻藻细胞在黑暗条件下进行同步化 处理48小时，然后将藻细胞接种到2L新的特定的四种浓度的f/2培养基中（表1)进行培 养，初始浓度为200〇cells/mL。光照强度30001x，培养温度20± 1°C，光暗周期为12h光照 /12h黑暗。采用滤膜过滤法分别从对照组和实验组收集藻细胞IO3~10 6个，分别作为对 照组和实验组，进行实验测定。对照组为中氮中磷条件下生长至第二天的藻细胞，实验组为 中氮中磷，高氮高磷，高氮和高磷条件下生长至第12天藻细胞。四种培养基浓度见表1，除 所示成分浓度外，其它与f/2培养基浓度一致。
[0044] 表1四种培养基浓度
[0045]
[0046] (2)RNA的提取
[0047] 用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据 说明书的指示进行：
[0048] 1)取出于-