急剧增加，生长进入平台期，而实验组2AACT为1. 14,此海域在做出检测20天后，赤潮没有 爆发。
[0119] 实施例3
[0120] (1)实验材料的培养与收集：
[0121] 2013. 05. 12从青岛胶州湾海域收集链状亚历山大藻，进行对照组和实验组处理。 对照组：将收集的IO3~10 6个藻细胞置于3L三角瓶2L海水中，用遮光布黑暗48小时进行 同步化处理，每隔2小时晃动一次，然后进行实验室培养，光照强度30001x，，温度20 ±I°C， 光暗周期为12h光照/12h黑暗，培养基为胶州湾海域过滤消毒海水，培养至第二天为生长 周期的延迟期，作为对照组；实验组：为继续在海域中生长的藻细胞，取样日期比对照组取 样时间点晚7天。
[0122] 采用滤膜过滤法分别从对照组和检测海域收集藻细胞IO3~106个，分别作为对照 组和实验组，进行实验测定。
[0123] (2)RNA的提取
[0124] 用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据 说明书的指示进行：
[0125] 8)取出于-液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放 入提前加入ImlTrizol的EP管中，震荡，于室温静置5min;
[0126] 9)用预冷的离心机离心5min(4°C，12000g);
[0127] 10)小心吸取上清液，移至新的I. 5mL的EP管中，立即后加入1/5体积（约200ul) 的氯仿，涡旋振荡15s，室温静置5min;
[0128]11)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的I. 5mL的EP管 中，加入月400ul的异丙醇，混匀后于室温静置IOmin;
[0129]12)离心IOmin(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75%的无水乙醇（约Iml)，洗 脱沉淀，室温静置5min后，离心
[0130] 13)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约IOmin;
[0131] 14)利用20-30yIDEPC水溶解沉淀；
[0132] (3)反转录：
[0133] 取2yLRNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另 各取IyLRNA溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop2000对RNA样品浓度和质量检 测。反转录反应使用Takara的RTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒，按照以 下程序进行：
[0134] 基因组DNA的去除。
[0136] 42°C保温2min，立即置于冰上。
[0137] 反转录反应
[0138] 配制反应液的过程在冰上进行。按以下表格体积加入各种成分。
[0139]
[0140] 反应步骤：37°C，15min;85°C，5sec;立即置于冰上。
[0141] 合成的cDNA置于-20°C保存。
[0142] (4)qPCR实验：
[0143] 对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物（如表2)进行qPCR 反应。qPCR反应使用罗氏的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)试剂盒，在 ABI7500荧光定量机器上进行。qPCR反应体系如下：
[0146] 荧光实时定量PCR的反应条件如下：
[0147]第一步，50°C，2min ;
[0148]第二步，95°C，2min ;
[0149]第三步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 个循环；
[0150]第四步，做熔解曲线：95。(：，15sec;6(TC，Imin;95。(：，15sec;6(TC，15sec〇
[0151] 荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。
[0152] (5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系
[0153]mt基因的相对表达量分析采用2AACT的相对定量方法。对照组AACT的计算方 法为：AACT= (CTnit-CT对照组-(CTnit-CT对照组，所以对照组的AACT= 0,即 2AACT= 1。实验组AACT的计算方法为：AACT= (CT^t-CT实验组-(CTnit-CT _基目）对照组；当实验组的2AACT>2时，表明mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量 计算过程及结果如下表5所示。
[0154] 表5mt基因和双内参基因的相对表达量
[0155]
【主权项】
1. 一种用于实时巧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物，其特 征在于：所述引物的序列如MT-Q-S和MT-Q-A所示。2. -种使用实时巧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的方法，其 特征在于：使用巧光定量PCR分析mt基因差异表达，Wcob和18SRNA为内参基因，W双内 参基因的Ct值来校准目的基因mt相对表达量，采用2AAET法进行数据的分析，Aact= (CTmt-CT内参基因）实验-(CTmt-CT内参基因）对照；当2 2时，链状亚历山大藻细胞将进入 爆发性生长状态；当2 2时，链状亚历山大藻细胞未进入爆发性生长状态。3. 根据权利要求2所述的使用实时巧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性 生长的方法，其特征在于：所述内参基因为：cob和18SRNA。4. 根据权利要求3所述的使用实时巧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性 生长的方法，其特征在于：所述内参基因的引物为： cob-S：TTTTCTTCAAACTCATTTCGGGAT；cob-A：TGGGCACAGCTTTTAACATAGCATA； 18SrRNA-S：GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGA； 18SrRNA-A：CAAATCACTCCACCAACTAAGAACGG〇5. 根据权利要求2-5任一项所述的使用实时巧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细 胞爆发性生长的方法，其特征在于：具体步骤如下： (1) 采用滤膜过滤法从目标海域收集链状亚历山大藻1〇3~10 6个，将收集的藻细胞置 于化=角瓶的化海水中，遮光布黑暗48小时进行同步化处理，每隔2小时晃动一次，然后 进行实验室培养，培养溫度为20±rC，光照强度30001X，光暗周期1化光照/I化黑暗，培 养基为检测海域过滤消毒海水，培养至第二天，作为对照组；实验组为继续在目标海域中生 长的海藻细胞；采用滤膜过滤法分别从对照组和实验组收集藻细胞1〇 3~10 6个，分别作为 对照组和实验组，进行实验测定. (2)RNA提取； (3) 反转录合成的cDNA: (4)qPCR： 利用对照组与实验组的反转录cDNA，进行qPCR反应；qPCR反应体系如下：巧光实时定量PCR的反应条件如下： 第一步，50°C，2min; 第二步，95°C，2min; 第S步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 个循环； 第四步，做烙解曲线：95°C，15sec;60°C，lmin;95°C，15sec;60°C，15sec; 巧光信号的采集设置在第S步后；收集每个重复的mt基因Ct值，内参基因 的Ct值，两个内参基因Ct值取几何平均值； (5)基因相对表达量分析 采用2 &&ET的相对定量方法对基因的相对表达量进行分析；Aact= (CTmt-CTg^基因） 实验-(CTmt-CT内参細）对照； 当2 2,链状亚历山大藻细胞将进入爆发性生长状态； 当2aaet< 2时，链状亚历山大藻细胞未进入爆发性生长状态。
【专利摘要】本发明涉及用于荧光定量PCR监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物，所述引物序列为MT-Q-S:TCCAGGTGGTGCGGAGGAGACT和MT-Q-A:CCCACGACCTTTTTCGGATTGC。该技术具有以下优点：1、实现真正预警预报；2、特异性强；3、灵敏度高；4、操作简单、迅速，具有很强的推广性；5、费用较低。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105002273
【申请号】CN201510402269
【发明人】隋正红, 任源源, 耿慧利, 张淑, 郭立亮, 商二磊
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月10日