液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放 入提前加入ImlTrizol的EP管中，震荡，于室温静置5min;
[0049] 2)用预冷的离心机离心5min(4°C，12000g);
[0050] 3)小心吸取上清液，移至新的I. 5mL的EP管中，立即后加入1/5体积（约200ul) 的氯仿，涡旋振荡15s，室温静置5min;
[0051]4)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的I. 5mL的EP管中， 加入月400ul的异丙醇，混勾后于室温静置IOmin;
[0052] 5)离心IOmin(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75%的无水乙醇（约Iml)，洗脱 沉淀，室温静置5min后，离心
[0053] 6)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约IOmin;
[0054] 7)利用20-30yIDEPC水溶解沉淀；
[0055] (3)反转录：
[0056] 取2yLRNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另 各取IyLRNA溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop2000对RNA样品浓度和质量检 测。反转录反应使用Takara的RTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒，按照以 下程序进行：
[0057] 基因组DNA的去除。
[0059] 42°C保温2min，立即置于冰上。
[0060] 反转录反应
[0061] 配制反应液的过程在冰上进行。加入以下各种成分。
[0062]
[0063] 反应步骤：37°C，15min;85°C，5sec;立即置于冰上。
[0064] 合成的cDNA置于-20 °C保存。
[0065] (4)qPCR实验：
[0066] 对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物（如下表2)进行 qPCR反应。
[0067] 表2 :目的基因和内参基因的引物序列
[0069] qPCR反应使用罗氏的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)试剂盒，在 ABI7500荧光定量机器上进行。qPCR反应体系如下：
[0071] 荧光实时定量PCR的反应条件如下：
[0072] 第一步，50°C，2min;
[0073] 第二步，95°C，2min;
[0074] 第三步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 个循环；
[0075] 第四步，做恪解曲线：95°C，15sec;60°C，Imin;95°C，15sec;60°C，15sec。
[0076] 荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。
[0077] (5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系
[0078] mt基因的相对表达量分析采用2AACT的相对定量方法。对照组AACT的计算方法 为：AACT= (CTmt-CT_基因）对照组-(CTmt-CT_基因）对照组，所以对照组的AACT= 0， 即2AACT= 1。实验组AACT的计算方法为：AACT= (CTmt-CT 实验组-(CTmt-CT _基目）对照组；当实验组的2AACT>2时，表明mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量 计算过程及结果如下表3所示。
[0079] 表3mt基因和双内参基因的相对表达量
[0080]
[0081] 经计算，实验组的2AACT为分别为14. 4, 32. 89, 32, 24. 25,均大于2,说明mt基因 表达量极显著性增加。在检测之后第4天藻细胞数量急剧增长，进入平台期。
[0082] 实施例2
[0083] (1)实验材料的培养与收集：
[0084] 2013. 09. 15从青岛胶州湾海域收集链状亚历山大藻，进行对照组、实验组和模拟 组处理。将收集的IO3~10 6个藻细胞置于3L三角瓶2L海水中，用遮光布黑暗48小时进行 同步化处理，每隔2小时晃动一次，然后进行实验室培养，光照强度30001x，，温度20 ±I°C， 光暗周期为12h光照/12h黑暗，培养基为胶州湾海域过滤消毒海水，培养至第二天为生长 周期的延迟期，作为对照组；模拟组：将收集于胶州湾海域的IO3~10 6链状亚历山大藻细 胞接种于高磷（氮浓度为768yM/L，磷浓度为144yM/L)f/2培养基中，光照强度30001x，， 温度20°C，光暗周期为12h光照/12h黑暗，进行培养，至第7天进入对数期，作为模拟组； 实验组：为继续在海域中生长的藻细胞，取样日期与模拟组一致。
[0085] 采用滤膜过滤法分别从对照组、模拟组和检测海域收集藻细胞IO3~10 6个，分别 作为对照组和实验组，进行实验测定。
[0086] (2)RNA的提取
[0087] 用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据 说明书的指示进行：
[0088] 1)取出于-液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放 入提前加入ImlTrizol的EP管中，震荡，于室温静置5min;
[0089] 2)用预冷的离心机离心5min(4°C，12000g);
[0090] 3)小心吸取上清液，移至新的I. 5mL的EP管中，立即后加入1/5体积（约200ul) 的氯仿，涡旋振荡15s，室温静置5min;
[0091] 4)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的I. 5mL的EP管中， 加入月400ul的异丙醇，混勾后于室温静置IOmin;
[0092] 5)离心IOmin(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75%的无水乙醇（约Iml)，洗脱 沉淀，室温静置5min后，离心
[0093] 6)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约IOmin;
[0094] 7)利用20-30yIDEPC水溶解沉淀；
[0095] (3)反转录：
[0096]取2yLRNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另 各取IyLRNA溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop2000对RNA样品浓度和质量检 测。反转录反应使用Takara的RTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒，按照以 下程序进行：
[0097]基因组DNA的去除。
[0103] 反应步骤：37°C，15min;85°C，5sec;立即置于冰上。
[0104] 合成的cDNA置于-20°C保存。
[0105] (4)qPCR实验：
[0106] 对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物（如表2)进行qPCR 反应。qPCR反应使用罗氏的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)试剂盒，在ABI7500荧光定量机器上进行。qPCR反应体系如下：
[0107]
[0108] 荧光实时定量PCR的反应条件如下：
[0109] 第一步，50 °C，2min;
[0110] 第二步，95 °C，2min;
[0111] 第三步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 个循环；
[0112] 第四步，做熔解曲线：95°C，15sec;60°C，Imin;95°C，15sec;60°C，15sec。
[0113] 荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。
[0114] (5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系
[0115] mt基因的相对表达量分析采用2AACT的相对定量方法。对照组AACT的计算方法 为：AACT= (CTmt-CT_基因）对照组-(CTmt-CT_基因）对照组，所以对照组的AACT= 0， 即2AACT= 1。实验组AACT的计算方法为：AACT= (CTmt-CT 实验组-(CTmt-CT _基目）对照组；当实验组的2AACT>2时，表明mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量 计算过程及结果如下表4所示。
[0116] 表4mt基因和双内参基因的相对表达量
[0117]
[0118] mt基因在模拟组2AACT为2. 694,在模拟组接种后做出检测的第7天，藻细胞数量