一种利那洛肽的固相合成方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物化学
技术领域：
，具体涉及一种利那洛肽的固相合成方法。【
背景技术：
】[0002]利那洛肽（Linaclotide)是迄今为止首个鸟苷酸环化酶激动剂（GCCA)类药物，2012年8月美国FDA批准上市，商品名为Linzess，该药为胶囊制剂，每日口服一次。该化合物由14个氨基酸组成的多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，分子式：C59H79N15O21S6，分子量为1526.8,其结构序列如下：[0003][0004]H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(三对二硫键为1-6、2-10、5-13)。[0005]肠易激综合征（IrritableBowelSyndrome，IBS)是一种常见的功能性肠病，以腹痛或腹部不适为主要症状，排便后可改善，常伴有排便习惯改变，缺乏町解释症状的形态学和生化学异常。便秘型肠易激综合征（IBS-C)是IBS的4种不同亚型之一。现今人们认为，1/3的IBS患者是IBS-C患者，具有慢性腹痛和便秘症状。功能性胃肠道疾病RomeIII诊断标准中包含IBS的诊断标准，即在过去3个月内具有反复发作性腹痛或腹部不适每周至少3天，症状开始于诊断前至少6个月，同时具有以下2种或2种以上表现：症状发作与排便频次改变相关；排便后症状改善；症状发作与排便性状改变相关。[0006]目前在中国，IBS的发病率在10%-20%左右，患者以中青年为主。在欧洲人群中，IBS的估计发病率超过10%。IBS对患者的日常生活会带来负面影响，造成了巨大的社会经济压力，也导致了患者不良的心理预后，在基层医疗体系和二级医疗体系中，该疾病在胃肠道疾病工作中占有绝大部分的比例。鉴于此疾病的复杂性，IBS尚无治愈手段，现有的治疗选择也极少。[0007]利那洛肽用于治疗便秘型肠易激综合症（IBS-C)和慢性特发性便秘（CIC)，是一种鸟苷酸环化酶C(GC-C)激动剂。它与肠道GC-C结合后，导致细胞内和细胞外环鸟甘酸(cGMP)浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激氯离子和碳酸氢根的分泌进入肠腔，主要是通过激活的囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR)离子通道，导致小肠液体增加和加速通过，加快胃肠道移行，从而增加排便频率；细胞外cGMP浓度升高会降低痛觉神经的灵敏度、降低肠道疼痛。[0008]此外，利那洛肽最常见的不良反应是腹泻，而且该药不能用于16岁及以下年龄的患者。[0009]关于利那洛肽的制备方法，国内外报道较少。2011年Miriam等人发表关于利那洛肽合成的文章（OptimizedFmocSolid-PhaseSynthesisoftheCysteine-RichPeptideLinaclotide,PeptideScience,2011，Volume96,Number1，pages69-80)。文章中米用三种不同的方法合成利那洛肽：（I)随机氧化策略即Cys的保护基全部采用Trt，固相合成线性粗肽后在液相中一步氧化得到利那洛肽；（2)半选择性策略即Cys保护基分别采用Trt和Acm，固相合成线性粗肽后分步氧化形成二硫键得到利那洛肽；(3)完全选择性策略即Cys的保护基米用[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMe0Bzl]、[2StBu+2Trt+2pMe0Bzl]，固相合成线性粗肽后分步逐对形成二硫键。第一种方法的随机氧化会得到多种异构体，导致目标肽纯度低，纯化困难，不适合大规模生产。第二种方法虽然相对于方法一有一定的优势，也无法完全避免异构体的产生。第三种方法虽然尝试多种保护基，但均未得到最终目标产物。[0010]中国专利CN102875655A合成利那洛肽线性肽树脂时Cys的保护基都采用Mmt，三对二硫键的形成采用GSH/GSSH的方法一步氧化；中国专利CN104231051A合成利那洛肽线性肽树脂时Cys的保护基5个采用Mmt和1个Trt，三对二硫键的形成用10%DMSO的方法一步氧化。这两种方法均属于随机氧化的方法，会得到多种异构体，导致目标肽纯度低，纯化困难，不适合大规模生产。[0011]中国专利CN104628826A合成利那洛肽线性肽时Cys的保护基均采用Trt，三对二硫键的形成也是采用随机氧化的方法，但是选择了强氧化剂碘单质氧化，虽然加快了反应速度，却更容易产生多种二硫键之间的错配，导致多种同分异构体的产生，给后续目标肽的分离纯化带来很大的困难。[0012]中国专利CN103626849A采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。合成线性肽树脂时Cys的保护基采用Hqm、Trt和Acm，采用分步脱除氧化的方法形成三对二硫键。但这个方法中的Fmoc-Cys(Hqm)-OH原料比较昂贵，合成脱除步骤也比较繁琐，不利于工业化生产。[0013]中国专利CN104231051A线性肽中Cys的保护基采用都Trt，并且合成线性肽采用片段对接，五肽片段与九肽片段通过硫酯交换和S-N酰基转移才得到线性肽，然后再采用GSH/GSSH氧化体系得到利那洛肽。该方法得到的线性肽步骤繁琐、成本高、产率低，而且最后的随机氧化易造成多种异构体，给后期的纯化带来困难。【
发明内容】[0014]本发明需要解决的技术问题是，提供一种完全定向形成三对二硫键的利那洛肽的固相合成方法，提高形成二硫键的准确率，反应条件温和，成本低，产品的纯化简单，收率高，适用于规模化生产。[0015]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：[0016]-种利那洛肽的固相合成方法，该方法包括如下步骤：[0017](1)利那洛肽树脂的制备：Fm〇c-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；以Fmoc-Tyr(tBu)-树脂为固相载体，采用逐一偶联的方式从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；[0018](2)将步骤⑴得到的利那洛肽线性肽树脂进行切害U，脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的所有氨基酸的侧链保护基，得到了含有Cys(Acm)和Cys(tBu)的保护基线性肽；[0019](3)氧化步骤（2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；[0020](4)脱除步骤⑶得到的单二硫环肽中Cys(Acm)中Acm保护基，同时形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；[0021](5)脱除步骤（4)得到的双二硫环肽中CyS(tBu)中的tBu保护基，同时形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；[0022](6)步骤（5)得到的三二硫环肽经HPLC制备纯化，冻干得到利那洛肽。[0023]步骤⑴中，所述的载体树脂为Wang树脂或2-ChlortritylChloride树脂，优选2-ChlortritylChloride树脂。[0024]步骤⑴中，所述的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，按l:(l~2):(2~4)的摩尔比分别称取溶胀后的载体树脂、Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、DIPEA，室温震荡1~3小时，直接向反应液中加入甲醇，甲醇与载体树脂的比例为0.8~Iml:lg，封闭30min，然后分别用二甲基甲酰氨和二氯甲烷、甲醇洗涤，抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-树脂。[0025]步骤⑴中，根据权利要求1所述的方法，其中所用的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到的14个氨基酸的线性全保护肽树脂如下：NH2-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(tBu)-Tyr(tBu)-树脂。其中，Fmoc为荷甲氧羰基，Acm为乙酰胺甲基，Trt为三苯甲基，OtBu为氧叔丁基，tBu为叔丁基。[0026]步骤（1)中，所述的从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，方法为：按1:(2~6):(2~6)的摩尔比分别称取溶胀后的H-Tyr(tBu)-树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸、偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的树脂，室温震荡反应1~3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶与DMF体积比为1:4的溶液处理2次，脱除Fmoc保护基，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤2~3次，用量为5~lOml/g树脂；[0027]其中，所述的偶联剂为：HOAt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DCC的摩尔比为1:1的混合物，H0Bt、HBTU和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物，HOBt当前第1页1 2 3