专利名称：转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸b含量的方法
技术领域：
本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及到在丹参中组合共转化金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因同时提高丹参中酚酸类成分迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。
背景技术：
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植物，以其根及根茎入药，为我国常用大宗药材之一。丹参的主要活性成分为脂溶性的丹参酮 类和水溶性的酚酸类，具有活血化瘀，通经止痛，清心除烦等功效，在临床上被广泛用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎症的治疗。伴随着丹参原药材需求量的日益扩大和规范化种植的需求，培育活性成分含量高的优良丹参新品种已成为丹参原药材生产中亟待解决的关键问题之一。基于传统中药多用其水煎剂的用药方式，以迷迭香酸和丹酚酸B为代表的水溶性酚酸类成分被普遍认为是丹参发挥药效的主要活性物质基础，更是受到研究者的普遍关注。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用，迷迭香酸作为抗炎镇痛药已于1990年在德国投放市场；丹参素和原儿茶醛是丹参治疗冠心病的主要有效成分；丹酚酸B是目前已知抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高、抗氧化活性最强的化合物，为2010年版《中华人民共和国药典》规定的丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用。随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，人工种植面积逐年增大。然而作为常异交植物，丹参种内变异较大，性状复杂。栽培丹参只种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定，成为丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的最大障碍之一。另夕卜，由于人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发，严重影响了药材的产量和质量。上述问题成为中药丹参药材产业发展的瓶颈。由于丹参野生资源几乎耗尽，目前药用丹参以人工栽培为主，而栽培中人们对丹参优良品种的选育重视不够，导致丹参质量良莠差异较大。因此，提高丹参中有效成分，尤其是迷迭香酸和丹酚酸B的含量，培育优异的丹参资源具有重要意义。为了提高品质、满足市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良以提高其药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。在诸多方法之中，利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的新品种，愈来愈受到人们的关注。以转基因技术为核心的现代分子育种技术在改良药用植物、丰富中药资源、提高抗病性和抗逆性、培养高天然药物含量的新型转基因药材中有着诱人的应用前景。但目前利用转基因技术提高丹参中丹参酚酸类成分的含量，特别是迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法尚无报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术的不足，提供一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括下述步骤I、金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因的克隆
提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，采用Primer Premier 5. O软件,设计金鱼草DeIiIa和Roseal基因编码框的上游引物、下游引物，并在金鱼草DeIiIa基因的上游弓丨物前引入BamH I限制性酶切位点和保护碱基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位点和保护碱某CAGGAGCTC,金隹草Delila某闵h游引物序列为Delila-F :5，-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3，，下游引物序列为 De I i Ia_R : 5 ’ -CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’;在金鱼草Roseal基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT,在下游引物前弓I入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC,金鱼草 Roseal 基因的上游引物为 Roseal-F :5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3，,下游引物为 Roseal-R :5’ -CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3> ;以金鱼草 cDNA 为模板，经聚合酶链式反应分别扩增金鱼草Delila基因和Roseal基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19-TSimple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a，连接产物与大肠杆菌DH5a的体积比为I : 10，连接产物转入100 μ L大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列，序列如下金鱼草Roseal基因atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa663金鱼草DeliIa基因
权利要求
1.一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于该方法包括下述步骤 Cl)金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因的克隆 提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，采用Primer Premier 5. O软件,设计金鱼草Delila和Roseal基因编码框的上游引物、下游引物，并在金鱼草Delila基因的上游引物前引入BamH I限制件酶切位点和保护碱基GAGGATCC,在下游引物前弓I入Sac I限制性酶切位点和保护碱某CAGGAGCTC,金隹草Delila基因上游引物序列为Delila-F :5，-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3，，下游引物序列为 De I i Ia_R : 5 ’ -CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’;在金鱼草Roseal基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GA AGATCT’在下游引物前引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC,金鱼草 Roseal 基因的上游引物为 Roseal-F :5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3>,下游引物为 Roseal-R 5，-CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3，以金隹草 cDNA 为模板，经聚合酶链式反应分别扩增金鱼草Delila基因和Roseal基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a，连接产物与大肠杆菌DH5a的体积比为I : 10，连接产物转入100 μ L大肠杆菌DH5a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列，序列如下 金鱼草Roseal基因atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa663 金鱼草Delila基因atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa 50gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct 100ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc 150tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa 200tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg 250agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct 300
2.根据权利要求I所述的转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在构建含有金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用EcoR I和HindII双酶切为:取植物表达载体pBI121、10XM Buffer、限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶HindII、二次蒸馏水于37°C反应小时10分钟，限制性内切酶EcoRI与限制性内切酶HindII、10XM Buffe、二次蒸馏水、植物表达载体pBI121的体积比为 3 :3 :5 19 20 ； 取植物表达载体pCAMBIA-1302、10 XMBufer、限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶Hindll、二次蒸馏水于37°C反应2小时10分钟，限制性内切酶EcoR I与限制性内切酶HindII、10XMBuffer、二次蒸馏水、植物表达载体pCAMBIA-1302的体积比为3 3 5 19 20。
3.根据权利要求I所述的转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在构建含有金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用BamHI和Sac I双酶切为取含有金鱼草Delila基因的pMD19_T Simple载体、IOXK Buffer、限制性内切酶BamH I、限制性内切酶SacI、二次蒸馏水于37°C反应2小时20分钟，限制性内切酶BamH I与限制性内切酶Sac IUOXK Buffer、二次蒸馏水、含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体的体积比为3 3 5 19 20 ； 取PCAMBIA1302+中间载体、IOXK Buffer、限制性内切酶BamH I、限制性内切酶Sac I、二次蒸馏水于37°C反应小时20分钟，限制性内切酶BamH I与限制性内切酶Sac IUOXKBuffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302+中间载体的体积比为3 3 5 19 :20。
4.根据权利要求I所述的转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在构建含有金鱼草Roseal基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用BglII和BstEII双酶切为取含有金鱼草Roseal基因的pMD19-TSimple载体、.10XHBuffer、限制性内切酶Bglll、二次蒸馏水于37V反应I小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII在60°C反应I小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEIIUOXHBuffer、二次蒸懼水、含有金鱼草Roseal基因的pMD19_T Simple载体的体积比为3 :3 :5 :.19 20 ； 取pCAMBIA1302+-DEL重组质粒、10XH Buffer、限制性内切酶BglII、二次蒸馏水于.37°C反应I小时20分钟后，再加入限制性内切酶BstEII在60°C下反应I小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEIIUOXH Buffer、二次蒸馏水、pCAMBIA1302+_DEL重组质粒的体积比为3 3 5 19 20o
全文摘要
一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量的方法，该方法包括金鱼草Rosea1基因和Delila基因的克隆、构建含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体、制备含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株4个步骤。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参中金鱼草Rosea1基因和Delila基因的表达；对转基因丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量同时进行高效液相色谱测定，筛选得到迷迭香酸和丹酚酸B含量同时提高的转基因丹参植株。采用本发明获得的转基因丹参植株，生长45天的干燥根中，迷迭香酸的含量为26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量达63.64±1.94mg/g，分别是同时期非转化普通丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的1.60倍和2.12倍。
文档编号A01H5/00GK102876713SQ201210352630
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者王喆之, 姚伟, 宋银, 王东浩, 陈玉芹 申请人:陕西师范大学