基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及基因的差异表达在口腔癌诊断中的 应用，更具体的涉及LRRC26基因的差异表达在口腔鳞状细胞癌诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，0SCC)是口腔领面部最为常见 的恶性肿瘤，根据国际抗癌联盟/美国肿瘤研究联合委员会(UICC/AJCC)分级，肿瘤早期（I、 II)通过手术治疗预后良好，但许多患者发现时即为肿瘤晚期（III、IV)或已出现无法治疗 的局部复发。口腔位于消化道和呼吸道的起始位置，重要器官密集，且位于颜面部，故而在 临床实践工作中对于肿瘤晚期和复发转移患者无法按"无瘤原则"进行彻底的根治性手术， 尽管辅以多种治疗手段，其五年生存率近年来任没有明显增加。近年来随着遗传学与分子 生物学的蓬勃发展，通过对口腔鳞癌发生发展的分子机制的研究，尤其是对癌变过程中关 键性基因的筛选及靶向治疗的转化研究，为口腔鳞癌提供一种新的治疗方法以补充甚至替 代现有的治疗手段。
[0003] 发明人通过高通量测序平台选取2例口腔鳞状细胞癌癌组织、癌旁组织及3例正常 组织的转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常组织中 差异表达明显的基因 LRRC26,进一步RT-PCR实验证实了LRRC26基因与口腔鳞状细胞癌组织 低表达，LRRC26与口腔鳞状细胞癌具有很好的相关性，可用于制备口腔鳞状细胞癌辅助诊 断或者预后制剂，具有重要的临床实际应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种治疗口腔癌制剂，所述治疗口腔癌制剂促进LRRC26基 因的表达。
[0005] 本发明的目的在于提供促进LRRC26基因和/或LRRC26蛋白表达的试剂在制备口腔 癌治疗制剂中的应用。
[0006] 进一步，口腔癌治疗制剂中含有促进LRRC26基因表达的载体。
[0007 ]进一步，口腔癌治疗制剂是指可以促进LRRC26基因的表达的制剂。本领域人员熟 知促进基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控目的基 因：包括但不限于增加 LRRC26基因的拷贝数、转染含LRRC26基因的过表达载体;通过转录水 平调控LRRC26基因：包括但不限于激活LRRC26基因的表达、激活调控LRRC26基因表达的启 动子、抑制负调控LRRC26基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制LRRC26基因表达的 抑制子进行干扰；通过转录后水平调控LRRC26基因：包括但不限于抑制促进LRRC26基因 mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进LRRC26基因表达的microRNA;通过翻译后水平调 控LRRC26基因：包括但不限于导入促进目的基因编码蛋白的分子、抑制负调控LRRC26基因 表达的蛋白、促进LRRC26基因表达的因子及蛋白的表达。
[0008]进一步，口腔癌治疗制剂会抑制口腔癌细胞增殖。
[0009] 本发明的目的在于提供检测LRRC26基因和/其表达产物的试剂在制备口腔癌诊断 剂中的应用。
[0010] 进一步，所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
[0011] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 LRRC26，进一步通过分子生物学方法验证了 LRRC26与口腔癌的关系：LRRC26在口腔癌患 者中低表达，与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备治疗口腔癌制剂和/或口腔癌诊断制 剂，具有重要的临床应用价值。
[0012] 本发明的目的在于提供LRRC26基因在制备口腔癌诊断制剂中的应用。
[0013] 进一步，所述的口腔癌的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测口 腔癌患者组织中LRRC26基因的表达。
[0014] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0015] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0016 ]所述的用于焚光定量PCR方法检测口腔癌中LRRC26基因的产品含有一对特异性扩 增LRRC26基因的引物;所述的基因芯片包括与LRRC26基因的核酸序列杂交的探针。
[0017] 所述的用于焚光定量PCR方法检测口腔癌中LRRC26基因的产品可以检测癌组织与 癌旁组织中LRRC26基因的表达，也可以检测癌组织与正常组织中LRRC26基因的表达。
[0018] 本发明的目的在于提供LRRC26基因表达产物在制备口腔癌诊断制剂中的应用。进 一步，所述的口腔癌的诊断制剂包括用免疫方法检测LRRC26蛋白的表达。优选所述免疫检 测方法检测口腔癌中LRRC26蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
[0019] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA JLISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。
[0020] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或外周血 切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标 记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2) 免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或外周血超薄切 片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微 孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体 检测相应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜 上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的 样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动 至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截 留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十 分方便。
[0021 ] 进一步，所述检测LRRC26蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中 的抗体可采用市售的LRRC26单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被LRRC26单克隆抗 体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止 液等。
[0022]进一步，所述检测LRRC26蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的LRRC26单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 LRRC26单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0023] 本发明的目的在于提供一种检测口腔癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒检测基因 LRRC26,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.1， 下游引物序列为SEQ ID NO.2。