一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，属于水产生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 泥嫩（Misgurnus anguillicaudatus)和大鱗副泥嫩（Paramisgurnus dabryanus) 分别隶属于鲤形目鳅科中的泥鳅属和大鳞副泥鳅属。这两种鳅在我国分布广泛，除我国西 部高原外，自南至北均有分布。因有着较高的食用和药用价值，它们越来越受到消费者的喜 爱。近年来，随着市场需求量的不断增加，这两种鳅类的野生资源量下降严重，导致了它们 的市场价格节节攀升，其市场经济价值不可小觑。目前，国内已经掀起了一股泥鳅和大鳞副 泥鳅的养殖热潮，大规模的生产使得优良的泥鳅和大鳞副泥鳅苗种的需求量迅速增加。然 而，目前水产市场上泥鳅种质资源混杂，纯种与杂种难以分辨。如果使用育性较低的杂种作 为亲本，从繁育的角度来说，会直接造成繁育场巨大的经济损失。同时，鉴别出泥鳅和大鳞 副泥鳅的纯种和杂种，是开展这两种泥鳅选育和杂交育种工作的重要前提，这直接关乎到 育种工作的成功与否。
[0003] 微卫星标记，又称简单序列重复（Simple sequence repeats，SSRs)，是目前为止 应用最为广泛的分子标记之一。其应用主要分为三个方向：遗传多样性研究、品种鉴定和亲 缘关系鉴定、以及遗传连锁图谱构建和QTL定位。线粒体DNA标记作为一种新型的分子工具， 拥有母系遗传的特点并且缺乏修复重组能力。泥鳅在我国存在多种染色体核型，以二倍体 和四倍体为主。因此，在进行泥鳅的繁育工作时，倍性鉴定一直是一个重要的内容，目前，人 们多利用血液进行泥鳅倍性检测，这对泥鳅的规格有一定的要求且对泥鳅也有一定的伤 害，如果能通过鳍条对泥鳅倍性进行判定，就能很好地解决上述的问题。
[0004] 近年来，国内泥鳅种质资源混杂，市场上出现了大量的泥鳅和大鳞副泥鳅杂种。目 前，虽有通过外部形态、分子标记等对泥鳅和大鳞副泥鳅进行鉴别的方法，却至今没有泥鳅 与大鳞副泥鳅纯种和杂种的鉴别方法。为繁殖和培育出优良的泥鳅苗种，本发明旨在提供 一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明针对目前泥鳅种质资源混杂、泥鳅与大鳞副泥鳅杂种大量出现的现状，提 供了一种能够鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法。
[0006] 本发明包括:筛选出4个泥鳅特有的微卫星SSR标记（2价8、2附9、4阶和4价7)、2个 大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和TO50)和1个已知可区分泥鳅和大鳞副泥鳅的线 粒体标记(MP)，设计以上7个标记的引物，并用该引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩 增，获得PCR扩增产物并进行凝胶电泳分析。同时，本发明还用鳍条进行待测样品的倍性检 测，对倍性结果和凝胶电泳结果进行综合分析，从而鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种。
[0007] 更加详细的方法如下：
[0008] (1)取待测样本，剪取部分尾鳍组织，将尾鳍组织分成两份，一份黄豆大小的尾鳍 组织用于倍性检测；另一部分的尾鳍组织存放在装满95%乙醇的1.5ml的离心管中，采用醋 酸铵/异戊醇法提取基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA浓度，并将样品的质量浓度 稀释至100ngAiL，-20°C保存备用；
[0009] (2)以步骤(1)中的黄豆大小的尾鳍组织为样本，利用倍性分析仪进行倍性检测；
[0010] (3)以步骤（1)中的DNA为模版，以7个标记的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物， 然后进行凝胶电泳分析；
[0011 ]所述7个标记的名称及其引物序列为：
[0012]
[0013] (4)对步骤(2)中获得的倍性结果和步骤（3)中获得的凝胶电泳结果进行综合分 析，二倍体的样本中，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是二倍体 泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ仅2个大鳞副泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本 是大鳞副泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况 下，线粒体标记的扩增产物为大小285bp条带的样本是二倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线 粒体标记的扩增产物为大小214bp条带的样本是大鳞副泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ三倍体的样 本中，在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒体标记的扩增产物为 大小285bp条带的样本是四倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线粒体标记的扩增产物为大小 214bp条带的样本是大鳞副泥鳅罕X四倍体泥鳅Λ四倍体的样本是四倍体泥鳅罕X四倍体 泥鳅Λ仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物。
[0014]所述步骤(2)的倍性检测方法为:加200yL细胞核提取液在黄豆大小的尾鳍组织样 本上，刀片切割数次，然后加800yL细胞染色液，避光染色lmin，接着用30μηι滤网过滤，然后 用PBS定容至800yL上倍性分析仪检测倍性。
[0015]步骤（3)中所述的PCR扩增的总体积为10yL，其中含lOOng/yL的模板DNA 0.5yL， 1 · OyL的 lOxBuffer，0 · 2yL的 10mmol/L dNTPs，0 · lyL的0 · 5IU/yL的Taq DNA聚合酶，lOnmol/ L正向及反向SSR引物各0.25yL，余量为双蒸水。
[0016]步骤(3)中所述的PCR扩增的程序为:PCR循环参数为:94°C5min;然后30个循环，每 个循环包括94°C lmin，退火温度下30s，72°C lmin;最后72°C5min延伸;然后4°C保存。
[0017] 步骤(3)中所述的凝胶电泳分析采用1.0 % -2.0 %的MetaPhor琼脂糖凝胶上电泳。
[0018] 本发明与现有技术相比的优点：
[0019] 本发明所阐述的方法是基于4个泥鳅特有的微卫星SSR标记（2N18、2N19、4N7和 4N17)、2个大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和PD50)、1个已知可区分泥鳅和大鳞副 泥鳅的线粒体标记(MP)、以及1种用鳍条进行泥鳅倍性检测的方法所建立的。利用本方法， 可高效且快速地对泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种进行鉴别，为解决目前泥鳅市场种质资源 混乱局面提供了一种准确快捷的鉴别方法。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例一中随机选择的一条二倍体泥鳅纯种的倍性检测图。
[0021 ]图2为实施例一的泥鳅特有的SSR标记4N7的PCR产物电泳检测部分结果，其中Μ为 DNA Mark I，DD1-DD5为二倍体泥鳅纯种样品，ΤΤ1-ΤΤ5为四倍体泥鳅纯种样品，ΡΡ1-ΡΡ5为 大鳞副泥鳅纯种样品，TP1-TP5为杂种TP样品，PT1-PT5为杂种PT样品。
[0022]图3为实施例一中大鳞副泥鳅特有的SSR标记TO30的PCR产物电泳检测部分结果， 其中Μ为DNA Mark I，DD1-DD5为二倍体泥鳅纯种样品，TT1-TT5为四倍体泥鳅纯种样品， PP1-PP5为大鳞副泥鳅纯种样品。
[0023]图4为实施例一中线粒体标记MP的PCR产物电泳检测部分结果，其中Μ为DNA Mark I，PD1-PD5为杂种ro样品，DP1-DP5为杂种DP样品。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
[0025] 实施例一：
[0026] 本实例所用的泥鳅与大鳞副泥鳅成鱼购买自湖北省武汉市白沙洲水