行 LRRC26 引物设计(NM_001013653.2)。
[0070] LRRC26的上、下游引物序列分别为：
[0071 ]上游引物：5 ' -GCATGTGCGAGCCTTCTG-3 ' ； SEQ ID N0 · 1
[0072] 下游引物：5 ' -TGGTGCCAGTGCTTCCAG-3 ' ； SEQ ID NO · 2
[0073] 产物长度为79bp。
[0074] 内参β-actin上、下游引物序列分别为：
[0075] 上游引物：5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'；SEQIDN0·3
[0076] 下游引物：5 ' -CCTTCATACATCTCAAGT-3 ' ； SEQ ID N0 · 4
[0077] 产物长度为103bp。
[0078] 2.3定量标准曲线的建立 [0079] 标准DNA模板的制备
[0080] 按照说明书，从口腔癌组织中，利用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA， 接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤 如下：1·将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解 并置于冰上备用。
[0081 ] 2.配置反应体系，总体积为20μ1:终浓度为50pg-5yg的RNA模板、2μ1 Primer Mix、 4μ1 dNTP Mix、4yl RT Buffer、lylSuperRT，加 RNase-Free Water补平到20μ1 〇 [0082] 3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0083] 4. 42°C孵育30-50分钟，85°C孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
[0084] 将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2XTaq MasterMix(货号CW0682)进行常规 PCR，反应体系和条件如下：2 X Taq MasterMix 25μ1、上下游引物各2μ1、cDNAO. 5yg、补平至 50μ1。反应条件为 94°C 预变性 2min; 94°C 变性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，30cycles;最 后72°C延伸2min。取样5yL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯 化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采 用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量（NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并 做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在10 8-102C〇pieS/ μL) 〇
[0085] 2.3敏感性实验
[0086] 取重组质粒按比例稀释为108、107、106、10 5、104、103、102个拷贝/^1^，进行荧光定量 PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为 108_10 2(3〇卩168/^1^，最小检出浓度为100(3〇卩168/^匕
[0087] 2.4 qRT-PCR检测LRRC26基因表达量
[0088] 取上述49例口腔癌组、癌旁组和23例正常组超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提 取总RNA，进而用U1 traSYBR-步法荧光定量PCR试剂盒（货号CW0660)进行RT-PCR。具体步 骤：
[0089] 1.将RNA模板、引物、2XUltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With R0X)、 SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
[0090] 2.RT-PCR反应体系（25yl):2XUltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX) 12.5以1、上游引物（1(^]\〇0.541、下游引物（1(^]\〇0.541、3卯6成1^71116]\^叉0.541、加1?嫩模 板（终浓度为l〇pg _l〇〇ng)、RNase_Free Water补平至25μ1 〇 [0091 ] 3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
[0092] 4.将热循环仪预热到45°C，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应： 反转录:45°C lOmin; 95°C5min 预变性，接 35 个循环:95°C 10s，60°C30s。
[0093] 对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11.5软件，相关数据采用x2检验和 Fisher确切概率法进行处理，P<0.05有统计学意义;qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软 件来计算。
[0094] 根据qRT-PCR的相对定量公式:2- Δ Ct X 100%，比较LRRC26基因在口腔癌组、癌旁 组和正常组中的表达水平。结果显示:qRT-PCR扩增结果稳定，其中LRRC26在正常组织、癌旁 组织中的表达水平在明显高于肿瘤组织，其中正常组织约为肿瘤组织的9倍、癌旁组织约为 肿瘤组织的7倍(具体见图1)，以上结果验证高通量分析结果中LRRC26在口腔癌组织中低表 达。
[0095]实施例4细胞的培养
[0096] 口腔鳞状癌细胞癌细胞株Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所， 采用含10 %胎牛血清、l〇〇U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，于含5 % 0)2的37°〇 饱和湿度培养箱中培养。
[0097] 细胞复苏：
[0098]首先将恒温水浴箱预热至37°C，细胞培养超净工作台台面用75%乙醇擦洗，然后 紫外灯消毒30min。细胞复苏的原则是快速融化，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即 融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。从液氮罐中 取出冻存管，插入浮板并迅速置入37°C水浴箱中，不停摇动尽快使管中液体融化。一般约 lmin内融化，用乙醇消毒冻存管外壁及双手，在超净工作台内用吸管吸出细胞悬液，注入 15ml离心管内并滴加10倍体积的新鲜培养液，吹打均匀后，800rpm离心5min，除去上清，再 重复用新鲜培养液洗一次。用新鲜培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入5%〇) 2的37°0饱和 湿度培养箱中静置培养，第二天观察贴壁生长情况及细胞形态，更换培养液或传代。
[0099] 细胞传代：
[0100]细胞传代待细胞生长至培养瓶底部80 %-90 %密度时，在超净工作台中将原来的 培养液吸除，用PBS缓冲液轻缓漂洗细胞1-2次，尽量洗去残余血清，弃PBS平衡盐溶液。加入 0.5-lml0.0 2 %EDTA+0.25%胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口盖好，于室温或 37°C条件下消化0.5-3min。倒置显微镜下观察消化细胞，随着时间的推移，原贴壁的细胞边 黑，逐渐趋于圆形，细胞之间间隙增大不再连接成片，表示此时消化适度。在细胞还未飘起 时立即加入适量含血清的新鲜培养液终止消化反应，并用吸管吸取培养瓶内培养液反复吹 打培养瓶底壁，使已消化的细胞脱离培养瓶底壁。吹打过程须按一定顺序操作，即要从一边 开始到另一边结束，尤其是培养瓶底壁四周的边缘地带，确保培养瓶底壁各处的细胞均被 吹打脱落。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现气泡，这些都对细胞有损 伤。收集经吹打后得到的细胞悬液至15ml离心管内，800rpm离心5min，除去上清，立即加入 含血清的新鲜培养液，轻缓吹打形成细胞悬液。按1:2或1:3分配传代培养，加入适量培养液 后旋紧培养瓶盖，并在培养瓶侧面做好标记，置5%〇)2的37°0饱和湿度培养箱中继续培养。 24-48h更换培养液，一般3-4天形成细胞单层即可传代，若不马上传代可更换培养液以供实 验用。
[0101] 细胞计数：
[0102] 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计 数。计数结果以每毫升细胞数表示，其原理和方法与血细胞技术相同。首先将待测细胞制成 均匀的细胞悬液，血球计数板及盖片擦拭干净，并将