一种16型、18型hpv病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒诊断技术领域，具体涉及16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定 量检测方法。
【背景技术】
[0002] 人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是导致宫颈癌的一个重要因素。在 全球范围内，宫颈癌的每年新发病例约50万人，死亡例数约25万人，在妇科肿瘤中发病率居 第2位。
[0003] HPV是球形DNA病毒，其基因组全长约8000bp，包括6个早期基因（E1、E2、E4、E5、E6 及E7)开放式阅读框(open-reading frame，0RF)、2个晚期基因（L1、L2)开放式阅读框以及1 个非编码长控制区（non-coding long control region，LCR)，其中，E6、E7基因为两个主要 的原癌基因。
[0004] HPV主要感染皮肤及粘膜鳞状上皮，分为2大类，皮肤型和粘膜型。粘膜型主要感染 人泌尿生殖道的黏膜上皮，导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系 大小，粘膜型HPV分为高危型(high-risk，HR)和低危型（lo W-risk，LR)。高危型主要有HPV-l6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66型 ；低危型主要有HPV-6、ll、40、42、43、44、 54、61、70、72和81型。分子流行病学和病毒学研究发现，冊￥感染宫颈可发展为宫颈癌，与 HPV型别有关，宫颈鳞状细胞癌患者中，HPV-16型和HPV-18型为主要感染亚型。
[0005] 目前，对人乳头状瘤病毒的常用病原学检测方法主要有聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)、核酸杂交检测(包括核酸印迹原位杂交、斑点杂交、原 味杂交、杂交捕获等）。核酸杂交检测方法操作复杂，而PCR检测方法操作简便且灵敏度较 高，可以进行HPV分型，实时PCR检测可以初步对病毒拷贝数进行相对定量。但是，该方法由 于没有设计病毒拷贝数的标准对照参比品以及拷贝数计算体系，因而对于病毒绝对拷贝数 的具体信息未能知晓。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在针对16型、18型HPV E6/E7基因构建标准品质粒，建立16型、18型HPV 荧光定量PCR绝对定量体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7 基因，为临床快速断定宫颈癌患者受到HPV病毒感染，并对宫颈癌患者组织中HPV DNA拷贝 数进行绝对定量，从而为宫颈癌的早防、早治提供技术支持。
[0007] 本发明通过下列技术方案实现:一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检 测方法，经过下列各步骤：
[0008] (1)构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒：
[0009] a.根据NCBI数据库中 16型HPV(NCBI Reference Sequence:NC_001526.2)和 18型 HPV(GenBank:AY262282.1)基因序列，针对E6/E7区，按下述设计特异性引物：
[0010] 16型HPV E6/E7的PCR正、反向引物：
[0011] HPV16 E6/E7For:5'-CGT AAC CGA AAT CGG TTG AAC-3'
[0012] HPV16 E6/E7Rev:5'-CAG CCT CTA CAT AAA ACC ATC-3'
[0013] 18型HPVE6/E7的PCR正、反向引物：
[0014] HPV18 E6/E7For:5'-AAC CGA AAA CGG TCG GGA CC-3'
[0015] HPV18 E6/E7Rev:5'-TAG CTT GTA CAT AAA ACC AGC-3'；
[0016] b.宫颈癌组织中总DNA的提取:先将lmL HPV组织保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中， 以13000rpm在4°C下离心5min;弃上清，向沉淀中加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液(pH 8.1)， 以13000rpm在4°C下离心5min;弃上清，再加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4°C 下离心5min，弃上清；向沉淀中加入200μ]^ξ度为0. lmg/mL的蛋白酶K裂解液，在50°C下消化 过夜；然后以95°C沸水煮沸变性lOmin;再以13000rpm在4°C下离心5min，将上清转移至 0.5mL EP管中，在-70°C下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA;
[0017] c.将步骤b所得16型、18型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物 分别扩增16型、18型的E6/E7，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得16型、18型HPV 目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；
[0018] d.将步骤c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得16型、18 型和58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定16型、18型HPV标准品质粒的浓度， 再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：
[0019] Number of copies(copies/yl) = (Amount X 6.0 2 2 X 1023)/(Length X 1 X 109 X 650)
[0020]其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μL)，Length代表模 板DNA长度；
[0021] (2)参照步骤（l)c所得16型、18型HPV目的基因序列分别设计下列16型、18型HPV E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：
[0022] 16型：HPV16 E6For:5'-TGC GAC GTG AGG TAT ATG ACT TTG-3'
[0023] HPV16 E6Rev:5'-ACG GTT TGT TGT ATT GCT GTT CTA-3'
[0024] 16型：HPV16 E7For:5，-TTA GAT TTG CAA CCA GAG ACA-3'
[0025] HPV16 E7Rev:5，-GCA CAA CCG AAG CGT AGA GTC-3'
[0026] 18型：HPV18 E6For:5，-ACA TTG GAA AAA CTA ACT AAC-3，
[0027] HPV18 E6rev:5，-TGC AGC ACG AAT GGC ACT GG-3'
[0028] 18型：HPV18E7For:5，-AATTCCGGTTGACCTTCTATG-3'
[0029] HPV18 E7Rev:5，-GCT CAA TTC TGG CTT CAC ACTT-3，
[0030] (3)利用步骤（l)d所得16型、18型HPV标准品质粒分别检测宫颈癌组织中的E6和E7 拷贝数，具体检测方法如下：
[0031] a.将步骤（l)d所得16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10-6,按 PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量 PCR检测直接获得16型、18型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR 检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log1Q作为Υ轴分别绘制16型、18型HPV标准品质 粒的标准曲线，进而得到16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线方程：
[0032] 所述PCR反应体系如下：
[0033]表1荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μ1)
[0034]
[0036] 米用的反应程序如下：
[0037]
[0038] b .按步骤（3) a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织 DNA，分别根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌组 织中HPV DNA的拷贝数。
[0039]所述步骤(3)a中用双蒸水按梯度稀释至10-6是指将16型、18型HPV标准品质粒分别 用双蒸水稀释成以下梯度:1 0-1、1 0-2、1 0-3、1 0-4、1 0-5、1 0-6。
[0040] 本发明是通过检索NCBI 16型、18型HPV基因组序列，针对16型、18型HPV Ε6/Ε7基 因，分别以31-934位点区域和41-980位点区域构建标准品质粒，即将16型、18型HPV Ε6/Ε7 基因区分别构建到一个载体上，建立16型及18型HPV荧光定量PCR绝对定量体系，该检测体 系的建立既可以通过检测Ε6基因，又可以通过检测Ε7基因，为临床快速断定宫颈癌患者受 到HPV病毒感染，并对宫颈癌患者组织中HPV病毒拷贝数进行绝对定量，从而对宫颈癌的早 防、早治提供参考。
[0041 ]本发明具备的优点和效果:本发明是针对16型、18型HPV Ε6/Ε7基因区构建标准品 质粒，即将16型和18型HPV Ε6/Ε7基因区分别构建到一个载体上，建立16型及18型HPV荧光 定量PCR绝对定量体系，该检测体系的建立既可以通过检测Ε6基因，又可以通过检测Ε7基 因，来达到对宫颈癌患者组织中的HPV DNA拷贝数进行绝对定量的目的，从而对宫颈癌的早 防、早治提供参考。
【附图说明】
[0042] 图1为16型、18型HPV E6/E7区域基因 PCR扩增片段；图中，M:marker DL1200;
[0043] 图2为实施例1荧光定量PCR检测直接获得的16型HPV标准品质粒E6基因的扩增曲 线；
[0044]图3为实施例1荧光定量PCR检测直接获得的16型HPV标准品质粒E6基因的溶解曲 线
[0045]图4为实施例1的16型HPV标准品质粒E6基因的标准曲线；
[0046]图5为实施例1荧光定量PCR检测直接获得的16型HPV标准品质粒E7基因的扩增曲 线；
[0047]图6为实施例1荧光定量PCR检测直接获得的16型HPV标准品质粒E7基因的溶解曲 线
[0048]图7为实施例1的16型HPV标准品质粒E7基因的标准曲线；
[0049]图8为实施例1荧光定量PCR检测宫颈癌组织样本直接获得的16型HPV E6