PV标准品E6基因检测结果 [0114：
[0115] 表13 18型HPV标准品E7基因检测结果
[0116]
[0117]
[0118] b.按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织中 提取的总DNA，获得宫颈癌组织样本中18型HPV E6、E7的扩增曲线（见图16)和溶解曲线（见 图17)，根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程(见图12和图15)，进而 获得宫颈癌组织样本中18型HPV DNA拷贝数(见表14和表15):
[0119] 表14宫颈癌组织样本中18型HPV E6基因检测结果
[0120]
表15宫颈癌组织样本中18型HPV E7基因检测结果
[0121]
[0122] 序列表
[0123] 16型HPV E6/E7区域的PCR正向引物(HPV16E6/E7For):
[0124] CGTAACCGAA ATCGGTTGAA C 21
[0125] 16型HPV E6/E7区域的PCR反向引物(HPV16E6/E7Rev):
[0126] CAGCCTCTAC ATAAAACCAT C 21
[0127] 16型HPV E6/E7区域目的基因 PCR全长(HPV16E6/E7):
[0128]
[0129] 16型HPV E6区域的荧光定量PCR正向引物(HPV16E6For):
[0130] TGCGACGTGA GGTATATGAC TTTG 24
[0131] 16型HPV E6区域的荧光定量PCR反向引物(HPV16E6Rev):
[0132] ACGGTTTGTT GTATTGCTGT TCTA 24
[0133] 16型HPV E6区域目的基因 PCR全长(HPV16E6):
[01341
[0135] 16型HPV E7区域的荧光定量PCR正向引物(HPV16E7For):
[0136] TTAGATTTGC AACCAGAGAC A 21
[0137] 16型HPV E7区域的荧光定量PCR反向引物(HPV16E7Rev):
[0138] GCACAACCGA AGCGTAGAGT C 21
[0139] 16型HPV E7区域目的基因 PCR全长(HPV16E7): ΓΩ14Ω1
[0142] 18型HPV E6/E7区域的PCR正向引物(HPV18E6/E7For):
[0143] AACCGAAAAC GGTCGGGACC 20
[0144] 18型HPV E6/E7区域的PCR反向引物(HPV18E6/E7Rev):
[0145] TAGCTTGTAC ATAAAACCAG C 21
[0146] 18型HPV E6/E7区域目的基因 PCR全长(HPV18E6/E7):
[0147]
[0148] 18型HPV E6区域的荧光定量PCR正向引物(HPV18E6For):
[0149] ACATTGGAAA AACTAACTAA C 21
[0150] 18型HPV E6区域的荧光定量PCR反向引物(HPV18E6Rev):
[0151] TGCAGCACGA ATGGCACTGG 20
[0152] 18型HPV E6区域目的基因 PCR全长(HPV18E6):
[0153]
[0154] 18型HPV E7区域的荧光定量PCR正向引物(HPV18E7For):
[0155] AATTCCGGTT GACCTTCTAT G 21
[0156] 18型HPV E7区域的荧光定量PCR反向引物(HPV18E7Rev):
[0157] GCTCAATTCT GGCTTCACAC TT 22
[0158] 18型HPV E7区域目的基因 PCR全长(HPV18E7):
[0159]
【主权项】
1. 一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步 骤： (1) 构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒： a. 根据NCBI数据库中 16型HPV (NCBI Reference Sequence: NC_001526.2)和 18型HPV (GenBank: AY262282.1)基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物： 16型HPV E6/E7的PCR正、反向引物： HPV16 E6/E7For:5'-CGT AAC CGA AAT CGG TTG AAC-3' HPV16 E6/E7Rev:5'-CAG CCT CTA CAT AAA ACC ATC-3' 18型HPV E6/E7的PCR正、反向引物： HPV18 E6/E7For:5'-AAC CGA AAA CGG TCG GGA CC-3' HPV18 E6/E7Rev:5'-TAG CTT GTA CAT AAA ACC AGC-3'； b. 宫颈癌组织中总DNA的提取:先将I mL HPV组织保存液吸入1.5 mL灭菌的EP管中，以 13000rpm在4°C下离心5min;弃上清，向沉淀中加入ImL Tris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm 在4°C下离心5min;弃上清，再加入ImL Tris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4°C下离心 5min，弃上清；向沉淀中加入200 uL浓度为O. lmg/mL的蛋白酶K裂解液，在50°C下消化过夜； 然后以95°C沸水煮沸变性IOmin;再以13000rpm在4°C下离心5min，将上清转移至0.5 mL EP 管中，在-70°C下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA; c. 将步骤b所得16型、18型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别 扩增16型、18型HPV E6/E7基因，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得16型、18 型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株； d. 将步骤（I)C所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得16型、18型 HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定16型、18型HPV标准品质粒的浓度，再按下列 公式计算标准品质粒的拷贝数： Number of copies(copies/yl) = (Amount X6.0 2 2 X 1023)/(LengthX I X IO9X650) 其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μL)，Length代表模板 DNA长度； (2) 参照步骤（I)c所得16型、18型HPV目的基因序列分别设计下列16型、18型HPV E6和 E7的荧光定量PCR特异性引物： 16型：HPV16 E6For:5'-TGC GAC GTG AGG TAT ATG ACT TTG-3' HPV16 E6Rev:5'-ACG GTT TGT TGT ATT GCT GTT CTA-3' 16型：HPV16 E7For:5'-TTA GAT TTG CAA CCA GAG ACA-3' HPV16 E7Rev:5'-GCA CAA CCG AAG CGT AGA GTC-3' 18型：HPV18 E6For:5'-ACA TTG GAA AAA CTA ACT AAC-3' HPV18 E6Rev:5'-TGC AGC ACG AAT GGC ACT GG-3' 18型：HPV18 E7For:5'-AAT TCC GGT TGA CCT TCT ATG-3' HPV18 E7Rev:5'-GCT CAA TTC TGG CTT CAC ACT T-3' (3) 利用步骤（l)d所得16型、18型HPV标准品质粒分别检测宫颈癌组织中的E6和E7拷贝 数，具体检测方法如下： a. 将步骤(l)d所得16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至1〇Λ按PCR反 应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检 测直接获得16型、18型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测 所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数Iog 1Q作为Y轴分别绘制16型、18型HPV标准品质粒的 标准曲线，进而得到16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线方程： 所述PCR反应体系如表1: 表1荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μ1)米用的反应程序如下：b. 按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织DNA，分 别根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌组织中 HPV DNA的拷贝数。2.根据权利要求1所述的绝对定量检测方法，其特征在于:所述步骤(3)a中用双蒸水按 梯度稀释至1〇_6是指将16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水稀释成以下梯度：10'10气 10-3、ιο-4、ιο-5、10-6。
【专利摘要】本发明提供一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过检索NCBI？16型、18型HPV基因组序列，获取HPV？E6/E7基因序列信息，分别以31-934位点区域和41-980位点区域构建16型、18型HPV？E6/E7标准品质粒，参照所得16型、18型HPV？E6/E7目的基因序列，分别在上述位点区域内设计16型、18型HPV？E6、E7荧光定量PCR特异性引物，利用所得16型、18型HPV？E6/E7标准品质粒分别检测宫颈癌患者组织样品的16型、18型HPV病毒拷贝数。该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，来达到对宫颈癌患者组织中的HPV？DNA拷贝数进行绝对定量的目的，从而对宫颈癌的早防、早治提供参考。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105483249
【申请号】CN201511018981
【发明人】孙强明, 席珏敏, 陈俊英, 潘玥, 王晓丹, 赵玉娇, 邱丽娟, 姜黎明, 罗佳
【申请人】中国医学科学院医学生物学研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月29日