、E7的扩 增曲线；
[0050]图9为实施例1荧光定量PCR检测宫颈癌组织样本直接获得的16型HPV E6、E7的溶 解曲线；
[0051 ]图10为实施例2荧光定量PCR检测直接获得的18型HPV标准品质粒E6基因的扩增曲 线；
[0052]图11为实施例2荧光定量PCR检测直接获得的18型HPV标准品质粒E6基因的溶解曲 线
[0053]图12为实施例2的18型HPV标准品质粒E6基因的标准曲线；
[0054] 图13为实施例2荧光定量PCR检测直接获得的18型HPV标准品质粒E7基因的扩增曲 线；
[0055] 图14为实施例2荧光定量PCR检测直接获得的18型HPV标准品质粒E7基因的溶解曲 线
[0056]图15为实施例2的18型HPV标准品质粒E7基因的标准曲线；
[0057]图16为实施例2荧光定量PCR检测宫颈癌组织样本直接获得的18型HPV E6、E7的扩 增曲线；
[0058]图17为实施例2荧光定量PCR检测宫颈癌组织样本直接获得的18型HPV E6、E7的溶 解曲线。
【具体实施方式】
[0059]下面通过实施例对本发明做进一步描述。
[0060] 实施例1
[0061] (1)构建16型HPV E6/E7标准品质粒：
[0062] a.根据 NCBI 数据库中 16 型 HPV E6/E7 的序列（NCBI Reference Sequence:NC_ 001526.2)，按表2设计特异性引物，扩增E6/E7区基因序列：
[0063] 表2 16型HPV E6/E7区域的PCR引物 「00641
[0065] b.宫颈癌组织中提取总的DNA:
[0066] 先将lmL HPV组织保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，13000rpm 4°C离心5min;弃上 清，向沉淀中加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液(pH 8.1)，13000rpm 4°C离心5min;弃上清，再 加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液，13000rpm 4°C离心5min，尽量倒尽残留的液体；向沉淀中加 入200μ1 0. lmg/mL蛋白酶K裂解液，50°C消化过夜;95°C沸水煮沸变性lOmin; 13000rpm离心 5min，将上清转移至0.5mL EP管中，-70°C冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA;
[0067] c.将步骤b所得16型HPV基因组通过PCR的方法，利用步骤（l)a的特异性引物扩增 16型HPV E6/E7基因，得到对应的扩增产物，再将扩增产物连接到pMD-18T Vector克隆载体 上，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得16型HPV目的基因序列鉴定正确的 阳性菌株；
[0068] d.将步骤（l)c所得序列鉴定正确的阳性菌株进行常规培养，获得16型HPV E6/E7 标准品质粒，并用紫外分光光度计测定16型HPV E6/E7标准品质粒的浓度，再按下列公式计 算标准品质粒的拷贝数：
[0069] Number of copies(copies/yl) = (Amount X 6.0 2 2 X 1023)/(Length X 1 X 109 X 650)
[0070]其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μL)，Length代表模 板DNA长度，16型HPV E6/E7标准品质粒DNA Length为3596bp。在该实施例中，紫外分光光度 计测得16型HPV E6/E7标准品质粒Amount为180ngAU，计算得16型HPV E6/E7标准品质粒拷 贝数为4.64X lC^copies/yl。
[0071] (2)参照步骤（l)c所得16型HPV E6/E7基因目的基因序列设计表3的E6和E7的荧光 定量PCR特异性引物：
[0072] 表3 16型HPV E6、E7荧光定量PCR引物
[0073]
[0074] (3)利用步骤（l)d所得16型HPV E6/E7标准品质粒检测宫颈癌组织中16型HPV DNA 拷贝数，具体检测方法如下：
[0075] a.将步骤（l)d所得16型HPV E6/E7标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10Λ即以下 梯度：10-\10-2、10-3、10-4、10-5、10- 6,分别使用 16型HPV E6、E7荧光定量PCR引物，按表4PCR 反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR 检测分别获得16型HPV E6/E7标准品质粒检测E6、E7基因的扩增曲线（见图2和图5)与溶解 曲线（见图3和图6)，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数 l〇gio(见表5、表6)作为Y轴绘制16型HPV E6/E7标准品质粒的标准曲线(见图4和图7)，进而 分别得到16型HPV E6/E7标准品质粒检测E6、E7基因的标准曲线方程:y = -0.301 lx+12.003 及 y = -0.3183x+12.323。
[0076] 所述PCR反应体系如表4:
[0077]表4荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μ1)
[0078]
[0079] 采用的反应程序如下：
[0080：
[0081:
[0082] 表5 16型HPV标准品Ε6基因检测结果 [0083]
[0084] 表6 16型HPV标准品E7基因检测结果
[0085]
[0086] b.按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织中 提取的总DNA，获得宫颈癌组织样本中16型HPV E6、E7的扩增曲线(见图8)和溶解曲线(见图 9)，根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程(见图4和图7)，进而获得 宫颈癌组织中16型HPV DNA拷贝数(见表7和表8):
[0087] 表7宫颈癌组织样本中16型HPV E6基因检测结果
[0088]
[0089]
[0090] 表8宫颈癌组织样本中16型HPV E7基因检测结果
[0091]
[0092]
[0093] 实施例2
[0094] (1)构建18型HPV E6/E7标准品质粒：
[0095] a·根据NCBI数据库中18型HPV E6/E7的序列(GenBank: AY262282 · 1)，按表9设计特 异性引物，扩增E6/E7区基因序列：
[0096] 表9 18型HPV E6/E7区域的PCR引物
[0097]
[0098] b.宫颈癌组织中总DNA的提取:先将lmL HPV组织保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中， 13000rpm 4°C离心5min;弃上清，向沉淀中加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液（pH 8.1)， 13000rpm 4°C离心5min;弃上清，再加入lmL Tris-HCl洗涤缓冲液，13000rpm 4°C离心 5min，尽量倒尽残留的液体；向沉淀中加入200μ10. lmg/mL蛋白酶K裂解液，50°C消化过夜； 95°C沸水煮沸变性lOmin; 13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mL EP管中，-70°C冻存，得 到16型、18型HPV基因组DNA;
[0099] c.将步骤b所得18型HPV基因组通过PCR的方法，利用步骤（l)a的特异性引物扩增 18型HPV E6/E7基因，得到对应的扩增产物，再将扩增产物连接到pMD-18T Vector克隆载体 上，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得18型HPV目的基因序列鉴定正确的 阳性菌株；
[0100] d.将步骤（l)c所得序列鉴定正确的阳性菌株进行常规培养，获得18型HPV E6/E7 标准品质粒，并用紫外分光光度计测定18型HPV E6/E7标准品质粒的浓度，再按下列公式计 算标准品质粒的拷贝数：
[0101 ] Number of copies(copies/yl) = (Amount X6.0 2 2 X 1023)/(LengthX1X109X 650)
[0102]其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μL)，Length代表模 板DNA长度，18型HPV E6/E7标准品质粒DNA Length为3632。在该实施例中，紫外分光光度计 测得18型HPV E6/E7标准品质粒Amount为276ngAU，计算得18型HPV E6/E7标准品质粒拷贝 数为 7 · 04 X 101QcopiesAU。
[0103] (2)参照步骤（1)〇所得18型HPV E6、E7区目的基因序列按表10设计E6和E7的荧光 定量PCR特异性引物：
[0104] 表10 18型HPV E6、E7荧光定量PCR引物
[0105]
[0106] (3)利用步骤（1)d所得18型HPV E6/E7标准品质粒检测宫颈癌组织中18型HPV病毒 拷贝数，具体检测方法如下：
[0107] a.将步骤(l)d所得18型HPV E6、E7标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10-6,即以下 梯度：10-\ 10-2、10-3、10-4、10-5、10- 6，分别使用表10中18型HPV Ε6、Ε7荧光定量PCR引物，按 表11PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒Ε6、Ε7基因的扩增效率和特异 性，通过荧光定量PCR检测分别获得18型HPV Ε6/Ε7标准品质粒检测Ε6、Ε7基因的扩增曲线 (见图10和图13)与溶解曲线(见图11和图14)，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值 作为X轴，标准品拷贝数1 〇g1Q(见表12和表13)作为Y轴绘制18型HPV E6/E7标准品质粒的标 准曲线（见图12和图15)，进而分别得到18型HPV E6/E7标准品质粒检测E6、E7基因的标准曲 线方程:y = -0.1785x+12.652&y = -0.4807x+13.525。
[0108] 所述PCR反应体系如表11:
[0109] 表11荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μ1)
[0110]
[0111]采用的反应程序如下：
[0112]
[0113] 表12 18型H