组织样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为2R2G， T0P2A基因未发生扩增。
[0033]图4为实施例4中乳腺癌组织样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为6-12R2G，T0P2A基因扩增。
【具体实施方式】
[0034]为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0035]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0036]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0037] 实施例1T0P2A基因检测探针的制备
[0038]本实施所述T0P2A检测探针的制备方法，包括以下步骤。
[0039] 挑选包含目的基因 T0P2A及两端序列的克隆，如图1所示。
[0040] GSP T0P2A包括两组，分别包括第一探针、第二探针、第三探针和第四探针.具体如 下表，其购买于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆库。以下分两组检测探针分别制备。 [0041 ] T0P2A chrl7:38，544，773-38，574，202，29，430bp
[0042]
[0043]
L〇〇44J (2)GSP T0P2A基因检测探针制备：使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Ki t，按照说 明书要求的操作方法对不同BAC克隆分别进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和 280nm处的吸光度对质粒DNA定量;采用高压灭菌的超纯水稀释为200ng/ul，采用1.5ml的离 心管分装，最后将得到的2种或4种质粒DNA混合，-20°C密封保存。
[0045] (3)通过切口平移方法对质粒DNA混合物进行荧光标记，每种探针标记的荧光素为 Spectrum-Orange。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在 冰上配制PCR反应体系。
[0046] 10XNT buffer 5ul
[0047] dTTP(lmM) 0.4ul
[0048] d3TPs(lmM) lul
[0049] Spectrum-Orange dUTP 0.6ul
[0050] OT 酶 lOul
[0051] 质粒 DNA(100ng/ul) 各2.5ul
[0052] 添加 H20 至总体积为50ul。。
[0053] 配完后震荡混匀，在25°C标记5小时，再80°C孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2%琼 脂糖凝胶做电泳，在500bp左右存在弥散的条带。
[0054]对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇，避光、冰上配制：
[0055] 标记产物 45ul
[0056] 醋酸钠（3mol/L) 5ul
[0057] 无水乙醇 125ul
[0058] 混匀后置于-70°C冰箱中至少2小时，4°C13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅 动沉淀，加入lml的70%乙醇，4°C13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光 干燥。使用1 u 1纯化水溶解沉淀，获得GSP T0P2A基因探针，避光、-20°C储存。
[0059] (4)GSP T0P2A基因探针验证:分别使用两组探针，以人类正常分裂中期淋巴细胞 滴片为待测样本进行两组探针的验证(检测方法参考现有技术和实施例3)。培养细胞中包 含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是 细胞核。两组探针的结果相同，如图2所示：中期染色体的FISH杂交结果图。图中可以看见染 色体17q21位置显示红色荧光信号，内控探针CSP17(17号染色体鉴别探针，可以标记出17号 染色体，购自SE17，D17Z1(KBI-20017，KREATECH)显示绿色荧光。图中可见T0P2A基因探针信 号明亮，人外周血培养细胞片中在中期染色体上可观察到灵敏度、特异性100%;使用石蜡 样本片进行杂交检测，可以清楚的记录T0P2A基因拷贝数。
[0060]实施例2: T0P2A基因检测试剂盒制备方法
[0061] T0P2A基因检测试剂盒包括有T0P2A杂交液和DAPI复染剂两个组分，其中T0P2A杂 交液包含实施例1所述的GSP T0P2A基因探针（分别为两组检测探针，对应两种试剂盒）、 CSP17探针（17号染色体鉴定探针）、用于杂交环境(促进杂交)的缓冲液组分、封闭重复序列 的COT Human DNA等。DAPI复染剂主要用于杂交后的细胞复染，其中的DAPI会与DNA结合，使 得细胞核显示出蓝色荧光，含有对苯二胺的复染剂可以保持荧光的稳定。
[0062] 具体配方如下：
[0063] (1)杂交液配制
[0064]
[0065] (2)DAPI复染剂配制
[0066] 10mg的对苯二胺溶于lml的PBS中，调节pH为9 · 0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20 °C储存。取2.5μ1的DAPI溶液(0. lmg/ml)溶于lml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20°C避光密闭保存。
[0067] (3)成品组装
[0068]
LQ〇69」买施例3: T0P2A基因检测试刑盆的检测万法
[0070] 1、玻片预处理
[0071] 1 · 1玻片放入65±5°C恒温箱中烤片过夜；
[0072] 1.2取出玻片，将其放入二甲苯中室温脱蜡15分钟；
[0073] 1.3取出玻片，再将其放入另一缸二甲苯中室温继续脱蜡15分钟；
[0074] 1.4取出玻片，再将其放入无水乙醇中室温10分钟，去除残留二甲苯；
[0075] 1.5取出玻片，再将其放入100%、90%、70%梯度乙醇室温复水各3分钟；
[0076] 1.6取出玻片，再将其放入纯化水中室温洗涤3分钟，用无绒纸巾吸取多余水分；
[0077] 1.7取出玻片，再将其放入纯化水中100±5°C煮片25分钟（切片水平放置于容器 中，样本面朝上）；
[0078] 1.8取出玻片，室温晾干；
[0079] 1.9将玻片正面朝上放在架子上，在样本区域滴加适量的胃蛋白酶反应液，消化5 ~15分钟；
[0080] 1.10将多余液体甩去，将其放入室温2 X SSC中5分钟；
[0081 ] 1.11取出玻片，再将其放入另一缸室温2 X SSC中5分钟；
[0082] 1.12取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各3分钟；
[0083] 1.13取出玻片，室温晾干。
[0084]胃蛋白酶的反应时间需要通过预试验进行确定。可以使用同批制备的样本片按所 述方法进行预试验，通常以5分钟为间隔时间。例如，分别测试消化时间为5分钟、10分钟和 15分钟，完成"玻片预处理"后，可以在明场下，使用10X或20X物镜观察组织消化状态;或 者直接进行DAP I复染，进行消化状态判断。
[0085] 2、样品和探针同时变性(避光操作）
[0086] 2.12.1从_20±5°C冰箱中取出实施例2所述检测试剂盒中的杂交液，震荡混匀，瞬 时离心；
[0087] 2.22.2加10μ1的杂交液到杂交区域，迅速盖上18 X 18mm盖玻片，轻压使杂交液均 勾分布，避免产生气泡；
[0088] 2.32.3用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位；
[0089] 2.42.4将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上 盖，设置"Denat&Hyb"程序，变性85°C 5分钟，杂交37°C 10~18小时。（若无杂交仪，可使用 替代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进