透明，升温至320°C，每分钟升高10°C。 升至320°C后，搅拌反应lh，反应结束。当温度降到室温后，以环氧己烷和氯仿洗去多余油 胺，真空干燥。
[0056] 2.合成R0S敏感的缩硫酮linker(TL)步骤如下：
[0057] 无水的3-疏基丙酸（5.2g，49. lmmol)和无水的丙酮(5.88,98.21111]1〇1)以干燥的!1〇1 气体饱和，在室温反应4h。反应产物结晶过滤，以己烷和冷水洗涤，硫醇1 inker真空冷冻干 燥得产物。TL具有R0S敏感性，其R0S敏感性测试结果见图7。
[0058] 3.合成TL-CPT实验步骤如下（如图3所示）：
[0059] TL(252· lmg，1 ·Ommol)溶于无水的 10mL DMF中，依次加入三乙胺（TEA，303·6mg， 3.0mmol)、2,4,6-三氯苯甲酰氯（241.9mg，1 .Ommol)、二甲氨基P比啶（DMAP，24.4mg， 0· 2mmol)，搅拌10min。溶于10mL DMF的喜树碱（174. lmg，0.5mmol)后加入，室温搅拌反应 24h。以水淬灭反应，以CH2C12萃取5次。粗产物过硅胶柱得纯品。
[0060] 4.装配 Ce6-CPT-UCNPs 的过程如下：
[0061 ] TL-CPT (0 · 06mmo 1，34 · 9mg)、mPEG-COOH(0 · 15mmo 1，300mg)和UCNPs (1 Omg)加入3mL DMF，150W超声lOmin后加入Ce6 (0.015mmol，9mg)超声5min，室温搅拌lh后离心三次 (11250g，10min/次），收集固体物质，以去离子水洗涤后重悬，装配过程如图1所示。
[0062] 如图4显示Ce6-CPT-UCNPs装配成功。如图5所示在980nm激光照射下，UCNPs和Ce6-CPT-UCNPs均发射出荧光。但在510nm激光照射下，UCNPs没有发射荧光，而Ce6-CPT-UCNPs发 射出荧光是由于存在Ce6,并非通过上转换方式发出。
[0063] 实施例二
[0064] 1.上转换材料UCNPs合成步骤与实施例一相同，这里不再赘述
[0065] 2.R0S敏感的缩硫酮linker(TL)步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0066] 3.合成TL-D0X实验步骤如下：
[0067] TL(252· lmg，1 ·Ommol)溶于无水的 10mL DMF中，依次加入三乙胺（TEA，303·6mg， 3.0mmol)、2,4,6-三氯苯甲酰氯（241.9mg，1 .Ommol)，二甲氨基P比啶（DMAP，24.4mg， 0 · 2mmol)，搅拌lOmin。溶于10mL DMF的阿霉素（D0X，271 · 76mg，0.5mmol)后加入，室温搅拌 反应24h。以水淬灭反应，粗产物过硅胶柱得纯品。
[0068] 4.装配 Ce6-D0X_UCNPs 的过程如下：
[0069] TL-D0X(0 · 06mmo 1)、mPEG-C00H( 0 · 15mmo 1)和UCNPs (1 Omg)加入3mL DMF，150W超声 lOmin后加入Ce6(0 · 015mmol)超声5min，室温搅拌lh后离心三次（11250g，lOmin/次），收集 固体物质，以去PBS缓冲液洗涤后重悬。
[0070] 实施例三
[0071] 1.上转换材料UCNPs合成步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0072] 2.R0S敏感的缩硫酮linker(TL)步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0073] 3.合成TL-CPT的实验步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0074] 4.装配 PheA-CPT-UCNPs 的过程如下：
[0075] TL-CPT(0 · 06mmol)、PheA(0 · 06mmol)、mPEG-C00H(0 · 15mmol)和UCNPs( 10mg)加入 3mL DMF，150W超声15min，室温搅拌lh后离心三次（11250g，10min/次），收集固体物质，以 HEPES缓冲溶液洗涤后重悬。
[0076] 实施例四
[0077] 评价单独的CPT、Ce6-UCNPs+980nm激光照射、Ce6-CPT-UCNPs+980nm激光照射对肺 癌细胞NCI-H460的治疗效果。
[0078] 为检测Ce6-CPT_UCNPs的化疗和光动力治疗的毒性，NCI-H460细胞(5X103cells/ 孔)种植于96孔板孵育24h。培养基以含有CPT、Ce6-UCNPs或者Ce6-CPT-UCNPs的培养基替 换。在暗处孵育4h，980nm 激光照射 Ce6-UCNPs和 Ce6-CPT-UCNPs组。0.6W/cm2 照射 20min，照 射lmin间隔lmin，共40min。在暗处孵育18h后，MTT法测细胞活力。
[0079]图8结果显示：在不同的剂量下，Ce6-CPT_UCNPs组光动力治疗和化疗联合治疗的 疗效比单独的光动力治疗和化疗效果好。
[0080]对于胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、 膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞也有类似的实验结果。这里不再赘述。
[0081 ] 实施例五
[0082]评价Ce6-CPT-UCNPs对原位肺癌的被动靶向和荧光成像功能。
[0083] 为建立原位NCI-H460肺癌模型，雌性BALB/c裸鼠（5周龄约17g)麻醉后，以70 %酒 精消毒，在胸腔肋骨最下缘线上方约1.5cm处，也就是肩胛骨内侧开5-7mm表皮切口，注入悬 浮于40yL PBS中的1 X 106个细胞后缝合，10-14天后模型基本建立。Ce6(2.5mg/kg)和〇66_ CPT-UCNPs(2.5mg/kg Ce6)尾静脉注入肺原位癌模型的裸鼠中，每组三只，用小动物荧光成 像系统Bruker In-Vivo F PRO imaging system采集图像，24h后杀掉小鼠，取心肝脾肺肾 采集Ce6荧光信号。激发光:630/20nm;发射光:700/30nm〇
[0084] 图9的Ce6-CPT_UCNPs处理组中，肺脏局部有很强的荧光信号，圆圈中所标注的是 肺脏肿瘤，和纳米颗粒的强荧光信号正好重合。这表明Ce6-CPT-UCNPs对原位肺癌有很好的 被动靶向作用。而单独Ce6组对肺癌没有靶向作用。此外，实验表明Ce6-CPT-UCNPs主要通过 肝脏代谢。
[0085] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种ROS响应的纳米药物递送系统，其特征在于，包括UCNPs、与所述UCNPs连接的羧 基化的PEG、光敏剂、R0S敏感的缩硫酮linker，以及与所述缩硫酮linker连接的抗肿瘤化疗 药物;所述光敏剂含有羧基且其激发光谱和UCNPs的发射光谱重合。2. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统，其特征在于，所述R0S敏感的缩硫 酮1 i nker的结构式是：其中，所述缩硫酮1 inker通过其羧基与所述抗肿瘤化疗药物连接。3. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统，其特征在于，所述UCNPs是NaYF4纳 米颗粒掺杂Yb3+作为敏感剂，Er 3+/Tm3+作为激活剂，呈现出上转换特性，980nm激光可激发出 645-675nm的窄光谱。4. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统，其特征在于，所述光敏剂包括二 氢卟吩e6和脱镁叶绿酸-A中的一种或者两种，其对应的结构式是：其中，左边是二氛卟吩e6,右边是脱儀叶绿酸-A。5. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统，其特征在于，所述抗肿瘤化疗药 物包括喜树碱、阿霉素、伊立替康、紫杉醇中的一种或者多种。6. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： 步骤一、UCNPs的合成； 步骤二、缩硫酮linker的合成:无水的3-疏基丙酸和无水的丙酮在干燥的HC1气体饱和 的情况下室温反应2_6h，反应产物结晶过滤，洗涤，真空冷冻干燥得产物缩硫酮1 inker; 步骤三、缩硫酮linker与抗肿瘤化疗药物连接:缩硫酮linker在无水的二甲基甲酰胺 中，在先加入三乙胺、2,4,6_三氯苯甲酰氯、二甲氨基吡啶的情况下，搅拌5-20min;将抗肿 瘤化疗药物加入，室温搅拌反应20-30h，粗产物过硅胶柱得连接有缩硫酮1 inker的抗肿瘤 化疗药物纯品； 步骤四、装配完整的R0S响应的纳米药物递送系统:连接有缩硫酮linker的抗肿瘤化疗 药物和11^6-〇)0!1以摩尔比为2:5~6的比例加入含1^^8的有机溶剂中，1^即 8质量为11^6-C00H的2.5%-3.3%，超声，加入质量为mPEG-COOH的5%-15%的光敏剂超声，室温搅拌1-2h 后高速离心洗涤，收集固体物质后重悬，得到所述ROS响应的纳米药物递送系统。7. 如权利要求6所述的R0S响应的纳米药物递送系统的制备方法，所述步骤四中的有机 溶剂是可同时溶解抗肿瘤化疗药物，mPEG-COOH和光敏剂的有机溶剂。8. 如权利要求1所述的R0S响应的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于，UCNPs的 合成步骤一具体为：CF3C00Na和Ln(CF 3⑶0)3以摩尔比2:1在油胺中反应，搅拌加热到110-120°C去除水分和氧气，通氮气搅拌0.5-2h，期间一直为通氮气状态，当反应液转为透明，升 温至320-330Γ搅拌反应l_2h，反应结束，以环氧己烷和氯仿洗去多余油胺，真空干燥，得到 UCNPs;其中，Ln (CF3C00) 3 中的 Ln 是 78mo 1 % Y+20mo 1 % Yb+1 · 6mo 1 % Er+0 · 4mo 1 % Tm。9. 如权利要求1所述的ROS响应的纳米药物递送系统作为制备抗肿瘤药物制剂的应用。10. 如权利要求9所述的一种R0S响应的纳米药物递送系统作为制备抗肿瘤药物制剂的 应用，其特征在于，980nm激光激发UCNPs发射出645-675nm光谱，通过FRET效应，部分645-675nm光被光敏剂二氢卟吩e6或脱镁叶绿酸-A吸收，光敏剂发射出的荧光或UCNPs发射出的 荧光，用于体内外荧光成像;光敏剂释放出R0S，用于肿瘤的光动力治疗;R0S切割缩硫酮 linker释放抗肿瘤化疗药物，用于肿瘤化疗。
【专利摘要】本发明公开了一种ROS响应的纳米药物递送系统，包括UCNPs、与UCNPs连接的羧基化的PEG、光敏剂、ROS敏感的缩硫酮linker，以及与缩硫酮linker连接的抗肿瘤化疗药物；光敏剂含有羧基且其激发光谱和UCNPs的上转换发射光谱重合。本发明还公开了该ROS响应的纳米药物递送系统的制备方法和应用。本发明的ROS响应的纳米药物递送系统可以在时间和空间上对药物释放进行控制，可进行光动力治疗和化疗联合治疗，一次将肿瘤根除，同时UCNPs发射的荧光或光敏剂发射出的光可进行荧光成像，因而可进行治疗成像一体化。
【IPC分类】A61K31/4745, A61K49/00, A61K41/00, A61P35/00, A61K31/704, A61K47/48
【公开号】CN105617379
【申请号】CN201610018636
【发明人】崔大祥, 岳彩霞
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月12日