负电荷的NP。其中的负电荷高分子可以为羧化壳聚糖、透明质酸、聚谷氨酸等。
[0022](4)如药物为疏水性药物，可以直接在(I)步骤中，将药物与疏水性高分子一起溶解于油相中进行包埋;如药物为亲水性药物，可以先溶解后作为内水相，采用复乳的形式进行负载，也可以在(2)或者(3)步骤中与荷电高分子一起吸附。
[0023]如图2所示，为了制备不同的荷电NP，首先以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)制备带负电荷的NP，通过后续吸附季铵化壳聚糖(HTCC)可以变为正电荷的NP++和NP+，进一步通过吸附负电荷的羧甲基化壳聚糖(CMC )可以变为负电荷的NP—和NP-，荷电量可以通过HTCC和CMC的浓度及取代度调节。
[0024]如图3所示，以制备好的荷电NP++为例，扫描电镜显示颗粒形貌完整，粒径约为150nm，电荷经测定为+36.4 mv0
[0025]如图4所示为不同的荷电NP置于稀释的凝胶中，在体外模拟微电场作用下的运动情况，其中NP—、NP-、NPO、NP+、NP++表示不同荷电情况，通过琼脂糖凝胶电泳考察不同荷电NP在模拟眼内微电场中的运动情况，正电荷NP在凝胶中能够趋向负极运动，负电荷NP则趋向正极运动，并且迀移距离与带电量正相关。以上结果说明不同荷电NP在眼内微电场的作用下将呈现不同的运动行为，正电荷NP将更趋向富集于负极化的眼底。
[0026]图5为不同荷电NP的眼底渗透情况，如图5a所示，为验证不同荷电NP的渗透情况，建立了体外渗透检测模型:将RF/6A在Transwel I上培养至单层，然后加入不同的荷电NP(荧光标记)，在小室中接入10mV稳压电极，小室上层插入正极，下层插入负极，于不同的时间点吸取下层培养液检测其中荧光信号，计算出累积荧光强度，从而反应相应的累积渗透情况。
[0027]如图5b所示为不同荷电的NP渗透单层RF/6A视网膜血管内皮细胞的定量数据，各组小室下层自给药Ih后荧光强度开始产生差异，并随着时间延长，差异逐渐增大。带正电荷的NP透过率远远大于带中性电荷和负电荷的NP，并且正电荷量越多，渗透效果越好。
[0028]如图5c为不同荷电的NP渗透单层RF/6A细胞的激光共聚焦照片，图中浅色为细胞膜，进一步的激光共聚焦图片显示，RF/6A细胞层中可以观察到大量的正电荷NP。除了通过细胞内转运渗透外，这些正电荷NP还可以透过细胞间途径进行渗透。为了区分明显，图中NP已用箭头标示。
[0029]如图5d所示，不同荷电的NP对离体猪眼视网膜的渗透情况，其中灰色部分的深灰色为细胞核，浅灰色为NP，在微电场条件下对剥离的新鲜猪视网膜给与不同荷电的NP，24h后共聚焦采用XZY模式扫描视网膜，观察NP对视网膜的渗透能力。带正电荷的NP渗透深度远远大于带中性电荷和负电荷的NP，并且正电荷量越多，渗透越深。为了区分明显，图中NP已用箭头标示。
[0030]图6为不同荷电NP的眼内分布情况，如图6a和6b，分别为注射不同荷电NP(荧光标记)后的离体眼球荧光成像和不同荷电NP的眼内滞留时间将不同荷电NP经玻璃体腔注射进入SD大鼠眼内，利用多功能活体小动物成像系统，取不同时间观察NP在眼内的分布情况，并对荧光进行定量。游离荧光分子注射后信号快速衰减，说明眼内代谢较快;而NP制剂可以在眼内停留更长的时间，信号衰减较慢。如图6c所示为不同荷电NP(箭头标示)在眼底的渗透情况，进一步用激光共聚焦对眼底层的冰冻切片进行扫描，正电荷NP组可以更多的富集于眼底;其中荷电量较少的NP+可以进入眼底浅部的神经视网膜内层，载药后适合于视网膜静脉阻塞等疾病的治疗；而荷电量较多的NP++可以进入较深的神经视网膜外层和脉络膜层，载药后适合于息肉样脉络膜血管样病变、老年黄斑变性等脉络膜视网膜疾病的治疗。
[0031]为评价NP的实际递送药物和相应的治疗效果，利用激光在距视盘I?2H)处围绕视盘避开血管击射视网膜，每只实验眼击射6?8个光凝点，建立脉络膜新生血管(choroidalneovascularizat1n，CNV)模型。基于不同的荷电NP负载药物地塞米松(DEX)，对CNV大鼠进行玻璃体腔注射，两周后观察眼底造影。如图7是不同荷电NP装载地塞米松用于脉络膜新生血管模型的治疗情况对比，如图7a所示，NP--、NP-和NPO组光凝斑(箭头标示)有明显的荧光渗漏，呈圆盘状强荧光;而NP+和NP++组的光凝斑(箭头标示)无明显荧光渗漏，呈弱荧光。进一步对脉络膜铺片进行观察(图7b)并进行相应的定量(图7c)，与NP—、NP-和NPO，正电荷组的血管密度显著降低，并且NP++组由于能将药物更准确地递送至眼底深部的CNV病变部位，效果也最为理想;治疗后大鼠眼压也处于正常水平，说明安全性较高。
[0032]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、称取一定量的油溶性高分子溶解于有机溶剂中作为油相，与水相混合后制备水包油型乳液； 步骤二、将步骤一的水包油型乳液在室温下搅拌过夜至有机溶剂挥发完毕，用蒸馏水离心洗涤若干次，得到纳微球； 步骤三、将上述制得的纳微球悬浮于不同浓度的亲水性正荷电高分子溶液中，在垂直混悬仪上孵育，进行正电荷修饰； 步骤四、通过高分子的浓度或者电荷基团的取代度来调节微球的电荷量， 至此，荷正电纳微球药物载体的制备完成。2.根据权利要求1所述的荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于:进行药物包埋时，若药物为疏水性药物，则在步骤一中将药物与油溶性高分子一起溶解于油相中进行包埋;若药物为亲水性药物，则先将其溶解为内水相，再采用复乳的形式进行负载，或在步骤三中与亲水性正荷电高分子一起吸附在纳微球上。3.根据权利要求1所述的荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，水包油型乳液的制备方法为搅拌法、超声法、沉淀法、均质乳化或微孔膜乳化法，优选能够制备出均一乳液的微孔膜乳化法。4.根据权利要求1所述的荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，采用的电荷修饰方法为吸附法或化学偶联法。5.根据权利要求1所述的荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于:所述步骤一中，油溶性高分子为聚乳酸类或聚酯类高分子。6.根据权利要求1所述的荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于:所述步骤三中，亲水性正荷电高分子为壳聚糖、季铵化壳聚糖、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸。7.—种荷正电纳微球药物载体，其特征在于:其利用权利要求1?6任意一项所述的方法制备形成，粒径范围为Inm?ΙΟμπι，优选10 nm?500 nm;电荷范围为0.1?200mv，优选5?50mvo8.根据权利7所述的荷正电纳微球药物载体作为眼内疾病治疗用药物定向转运载体的应用。9.根据权利要求7所述的荷正电纳微球药物载体作为眼内疾病治疗用药物定向转运载体的应用，其特征在于:所述眼内疾病为老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、巨细胞病毒性视网膜炎或急性视网膜坏死。10.根据权利要求8或9所述的荷正电纳微球药物载体作为眼内疾病治疗用药物定向转运载体的应用，其特征在于:所述眼内疾病治疗用药物是小分子化学药物、蛋白质多肽类药物、抗体药物或基因药物等其中的一种或者多种联用。
【专利摘要】本发明提供了一种眼用荷正电纳微球药物载体及其制备方法，所述的药物载体带正电荷，粒径范围为1nm～10μm，优选10nm～500nm；电荷范围为0.1～200mv，优选5～50mv。经过玻璃体腔注射后，上述载体在眼内微电场作用下富集于眼底；通过调节载体的荷电量，还可以进一步调控载体渗透进入眼底的不同亚层。因此，上述载体对眼底亚层病变部位具有多级靶向作用，从而解决药物生物利用度低，毒副作用大等问题，显著提高治疗效果。本发明涉及的药物载体可使用的原料来源广泛，可针对不同眼底疾病装载不同的药物，具有普适性，实现在眼内的定向转运。
【IPC分类】A61K47/36, A61P27/02, A61K47/34, A61K9/00
【公开号】CN105617389
【申请号】CN201610168841
【发明人】陶勇, 魏炜
【申请人】首都医科大学附属北京朝阳医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月23日