专利名称：Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及利用基因诊断遗传性疾病的方法，具体的说是一种Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
1871年德国眼科医师Theodor Leber首次报道一家族遗传性视神经病变，主要表现为急性或亚急双侧中心视力丧失，仅通过母系传递，常累及青年男性，现称为Leber氏遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)。1988年Wallace等首次发现LHON与线粒体DNA(mtDNA)G11778A突变相关，至今已报道的相关mtDNA突变有40多种，其中90％-95％的LHON患者与三个原发性mtDNA突变(G11778A，G3460A和T14484C)相关。不同种族各种原发致病突变位点分布情况不同，白种人种中90％以上的LHON患者有G11778A，G3460A和T14484C位点中的一个突变，欧洲患者的这3个突变分别占50％～70％、15％～25％和15％；亚洲人群LHON家系中G11778A位点突变率很高，占90％以上。郭向明等对140例中国人LHON患者mtDNA 3个原发致病突变G11778A，G3460A和T14484C位点进行突变频谱分析，发现其突变率分别为92.9％、1.4％和5.7％。因此，利用基因鉴别诊断手段筛查LHON患者的首选就是分析mtDNA 3个原发致病突变位点。
针对Leber氏遗传性视神经病变的早期临床诊断较难，特别是散发病例(即无家族病例史)，利用基因诊断成为确诊该疾病的有力手段。LHON的mtDNA位点突变检测方法很多，其原理都是基于PCR技术，包括传统的等位基因特异性PCR、SSCP-PCR、RFLP-PCR和线粒体基因组DNA测序等，这些方法的第一步都需要提取外周血样中的mtDNA，有的还从分离淋巴细胞开始，所需时间较长、费用较高。传统的等位基因特异性PCR较其他方法具有快速、简单等特点，但一次PCR只能鉴别一个突变位点；RFLP-PCR法所用的限制性内切酶受诸多因素影响常常导致酶切反应失败，造成结果误判；SSCP-PCR法不仅耗时费用高，且实验条件要求较高等因素影响了对LHON的临床基因诊断的开展；而mtDNA全基因组测序价格昂贵等原因只适应于科研。Yohsuke Minatogawa等报道一种直接利用全血细胞裂解液作模板进行PCR反应，该方法需要microLYSISTM buffer(COSMO BIO Co.Ltd)来裂解细胞。
与本发明相关发明专利是1997年2月19日公开的“Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒(申请号96116296.1)”，该发明仅针对线粒体DNAG11778A位点突变的LHON患者，需要溶血液经变性提取总DNA，PCR扩增目的基因片断以及SfaNI限制性内切酶消化和电泳等繁琐的步骤，不仅耗时而且增加了相应的费用。
因此，建立一套快速、简易、特异性好又灵敏度高的LHON基因诊断技术体系及制备其试剂盒将有助于普及推广该病的临床基因诊断。
从包括中国专利在内的有关资料检索表明，利用全血样等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR同时检测LHON线粒体DNA 3个原发性突变位点尚未见到其相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于为临床提供一种快速、简易基因诊断Leber氏遗传性视神经病变的检测方法及其试剂盒。
本发明依据国内外对Leber遗传性视神经病变的分子遗传学研究的结果，发现人类90％以上的Leber遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病突变位点(G11778A，G3460A和T14484C)，利用等位基因位点特异性PCR法检测线粒体DNA的点突变，就能达到明确检测本遗传性疾病的目的。
本发明提供的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒，是以直接加入全血样作DNA模板，利用等位基因位点特异性多重PCR方法，同时检测LHONmtDNA的3个原发致病性突变位点(G11778A，G3460A和T14484C)。该试剂盒包括的3对PCR引物的上游引物3’-末端为突变碱基，通过优化的PCR反应条件，PCR仅能在带有点突变的患者血样中进行扩增反应，而正常人没有PCR扩增的产物。因此，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色和紫外检测PCR产物的有无以及PCR产物片段的大小，就能确诊本病，即如果PCR产物长为222bp，则为G11778A突变的LHON患者；PCR产物为294bp，则为T14484C突变患者；PCR产物为360bp，是G3460A位点突变患者；若出现2条带，比如一条PCR产物长为222bp，另一条为294bp，则说明该LHON患者含有G11778A和T14484C 突变，其余的依次类推；若出现3条带，则说明该LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三突变。一般来说LHON患者中出现双位点突变是非常非常之稀少，仅见国外报道1例，而同时具有这3个位点突变的LHON患者目前仍未见报道。
本发明提供的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒主要针对具有3个原发性致病突变位点(G11778A，G3460A和T14484C)的Leber氏遗传性视神经病变患者的基因诊断。
本发明提供的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒，其特征在于该基因诊断试剂盒是直接利用全血样作PCR的DNA模板，不需要纯化血样中的DNA，而且只需要0.5-1.0μl的微量血样。
本发明提供的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒，其特征在于该基因诊断试剂盒是利用等位基因位点特异性多重PCR(MAS-PCR)法，通过优化PCR反应条件，实现单管一次性PCR反应同时检测mtDNA的3个原发致病性突变位点(G11778A，G3460A和T14484C)来诊断LHON疾病。
本发明的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒组成部件见下表-1表-1 Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒组成1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl)50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM) 800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer 1ml上述试剂盒中PCR引物是根据人类线粒体基因组DNA(mtDNA)序列以及mtDNA G11778A、G3460A和T14484C点突变设计的，即在3条上游PCR引物的3’-末端设计为突变碱基，其DNA序列见下表-2表-2 MAS PCR primers组成及其序列引物名称 核酸位置引物序列MS11778F11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R 11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R 14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’用本发明上述试剂盒基因诊断Leber氏遗传性视神经病变的方法，按下列步骤进行1) 按下表配制MAS-PCR反应体系(25μl)，混匀置于PCR仪上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM)1.5μl全血样本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.13μldH2O 19.37μl2) 按以下列条件进行PCR扩增反应94℃4min预变性→94℃30sec 30个循环→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃45sec3) 反应结束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl经1.5％-1.8％的琼脂糖凝胶电泳15-20分钟后于紫外仪上观察。若出现222bp大小的PCR产物，则为G11778A点突变的LHON患者；若出现294bp大小的PCR产物，则为T14484C点突变的LHON患者；若出现360bp大小的PCR产物，则为G3460A点突变的LHON患者；若出现2条带，比如一条PCR产物长为222bp，另一条为294bp，则说明该LHON患者含有G11778A和T14484C双突变，其余的依次类推；若出现3条带，则说明该LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三个位点突变；若没有特异性PCR产物条带，则90％以上可以排除其为LHON患者。
本发明的有益效果是由于本发明是以直接加入全血样作PCR的DNA模板，利用MAS-PCR法，通过优化PCR反应条件，实现单管一次性PCR反应同时检测LHONmtDNA的3个原发性致病突变位点(G11778A，G3460A和T14484C)。因此，该方法较目前检测LHON mtDNA位点突变的方法具有明显的三大优点1)直接采用外周全血样作DNA模板，不需要额外的细胞裂解和纯化mtDNA，因此大大缩短诊断的时间和减少相应的费用；2)所需血样量少，仅需要末梢一滴血样就可以进行诊断，这也解决了老年人和小孩血样采集较难的问题，且可将血样保存于滤纸上通过邮寄进行诊断；3)单管一次性PCR同时检测LHONmtDNA的3个原发致病突变位点，能够覆盖90％以上的LHON患者的诊断，而且具有更快速、简易和高效等优点。由此可见，该方法克服了目前LHON的临床基因诊断的缺点，非常适合于LHON的快速临床基因诊断，具有巨大的普及推广应用价值。
图1利用本发明提供的试剂盒进行等位基因特异性多重PCR法检测LHONmtDNA 3个原发性致病突变位点的电泳结果。其中，MDNA分子量标准X174-HincIIdigest；AmtDNAG11778A点突变的LHON患者血样；BmtDNAT14484C点突变的LHON患者血样；CmtDNA G3460A点突变的LHON患者血样；DmtDNA G11778A和T14484C点突变的LHON患者混和血样；EmtDNA G11778A和G3460A点突变的LHON患者混和血样FmtDNA T14484C和G3460A点突变的LHON患者混和血样；GmtDNA G11778A、T14484C和G3460A点突变的LHON患者混和血样；H正常人血样(阴性对照)。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明实施例1本发明的Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒该试剂盒组成(400次反应量)1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl)50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM)800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer1ml上表中MAS PCR primers组成及其DNA序列引物名称 核酸位置引物序列MS11778F 11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F 14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’实施例2基因诊断Leber氏遗传性视神经病变的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1) 按下表配制MAS PCR反应体系(25μl)，混匀置于PCR仪上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM)1.5μl全血样本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.13μldH2O 19.37μl
2) 按以下列条件进行PCR反应94℃ 4min预变性→94℃ 30sec 30个循环→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃ 45sec3) 应结束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl经1.5％-1.8％的琼脂糖凝胶电泳15-20分钟后于紫外仪上观察。若出现222bp大小的PCR产物，则为G11778A点突变的LHON患者；若出现294bp大小的PCR产物，则为T14484C点突变的LHON患者；若出现360bp大小的PCR产物，则为G3460A点突变的LHON患者；若出现2条带，比如一条PCR产物长为222bp，另一条为294bp，则说明该LHON患者含有G11778A和T14484C双突变，其余的依次类推；若出现3条带，则说明该LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三个位点突变；若没有特异性PCR产物条带，则90％以上可以排除其为LHON患者(见图1)。
权利要求
1.一种Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒的部件组成如下表1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM) 800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer 1ml其中，MAS PCR primers的组成及其DNA序列如下表引物名称核酸位置 引物序列MS11778F11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt 5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R 11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R 14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt 5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’
2.一种临床基因诊断Leber氏遗传性视神经病变的方法，其特征在于使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1)按下列组分配制MAS-PCR反应体系(25μl)，混匀，置于PCR仪上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM) 1.5μl全血样本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μlddH2O 19.37μl2)按以下列条件进行PCR扩增反应94℃4min预变性→94℃30sec 30个循环→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃45sec3)反应结束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl经1.5％-1.8％的琼脂糖凝胶电泳15-20分钟后于紫外仪上观察。若出现220bp大小的PCR产物，则为G11778A点突变的LHON患者；若出现292bp大小的PCR产物，则为T14484C点突变的LHON患者；若出现360bp大小的PCR产物，则为G3460A点突变的LHON患者；若出现2条带，比如一条PCR产物长为220bp，另一条为292bp，则说明该LHON患者含有G11778A和T14484C双突变，其余的依次类推；若出现3条带，则说明该LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三个位点突变；若没有特异性PCR产物条带，则90％以上可以排除其为LHON患者。
全文摘要
本发明公开了一种Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，属利用基因诊断遗传性疾病的方法。该发明是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A，G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA 3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。
文档编号C12Q1/68GK1661116SQ20051000609
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月11日 优先权日2005年1月11日
发明者阳菊华, 童绎, 陈贻锴, 林宇岚 申请人:福建医科大学