专利名称：Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类医学卫生领域，是一种检测Leber氏遗传性视神经病变的方法及其试剂盒。
Leber氏遗传性视神经病变是母系遗传的一种并不少见的眼病。常在青春期发病，男性多见，主要表现为视神经受损，即双眼先后或同时出现中心视力的急剧下降，数月后呈现视神经萎缩。此病的临床症状及眼底表现与急性球后视神经炎、视盘血管炎很相象，因此临床上常易误诊。临床上为明确诊断主要依靠家族遗传史(见1.《Leber氏病一家四例报告》中华眼科病杂志1993年第9卷第2期；2.《Leber氏家族遗传性视神经萎缩》实用眼科杂志1991年第9卷第11期)，但是有些患者很难问出家族遗传史，另外目前我国实行人口控制，大多数为独生子女，家族遗传史不易显露。到目前为止，还未见有抛开家族遗传史而检测Leber氏遗传性视神经病变的方法。
本发明的目的在于为临床提供一种不需依靠家族遗传史就能检测Leber氏遗传性视神经病变的方法及其试剂盒。
本发明的发明人根据近年来国内外和自己对本病从分子遗传学研究的结果，发现Leber氏遗传性视神经病变的患者存在线粒体的点突变。由于线粒体点突变的存在，使得正常线粒体DNA中人类高度保守的限制性内切酶SfaNI的识别位点丧失。进而，使得线粒体产能效率下降，导致细胞氧化和呼吸功能障碍，尤其是使最易受线粒体产能影响的前部视神经无髓纤维、视神经节细胞的轴突，因细胞供能不足以维持它们的完整结构与功能，最后发生退行性变化。线粒体的点突变被视为与本病致病有关，利用PCR方法检测出线粒体的点突变，就能达到明确检测本病的目的。
本发明提供的检测Leber氏遗传性视神经病变的方法和使用本试剂盒，是在采取患者的1毫升静脉血中，加入特定的抗凝剂，经变性法提取总DNA(包括线粒体DNA)，以PCR方法扩增特异的mtDNA片段，再用SfaNI限制性内切酶切割。正常人，经PCR扩增的产物能被SfaNI限制性内切酶切割，而Leber氏遗传性视神经病变患者，其PGR扩增产物则不能被SfaNI限制性内切酶切割，从限制性内切酶SfaNI的识别位点丧失可查出线粒体的点突变，因而对本病可作明确检测。
下面进一步阐述本发明的具体制备与操作步骤。
本发明的Leber氏遗传性视神经病变检测试剂盒的试剂和溶血液制备或生产单位1、特定的抗凝剂EDTANa 2gNaCl0.85g加水至 100ml室温溶解，每100微升特定抗凝剂抗凝1毫升静脉血。
2、一对引物由上海植物生理研究所或上海生物化学研究所提供成品。
5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′轻链POS.11641～11660，每微升500纳克。
5′GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重链POS.11980～11961，每微升500纳克。
3、PCR试剂dNTP200毫微克10×Buffer 5微升TaqDNA多聚酶1.2单位4、限制性内切酶SfaNI(New England Biolabs产)NEBuffer3(New England Biolabs产)5、溶血液Tris-Hcl 10mmol/L PH7.5 NaCl 10mmol/L，MgCl25mmol/L.
本发明的Leber氏遗传性视神经检测试剂盒的组成1、特定的抗凝剂一管2、一对引物各一管3、dNTP一管4、TaqDNA多聚酶一管5、10×Buffer一管6、限制性内切酶SfaNI一管7、NEBuffer3一管8、溶血液一管本发明的具体操作方法如下；抽取患者外周静脉血1毫升，加入特定抗凝剂100微升中，轻轻混匀后成抗凝血，再取抗凝血50微升置于400微升溶血液中轻轻混匀，静置5分钟，经4000rpm离心5分钟后弃上清，加入100微升生理盐水混匀，置100℃沸水7分钟，4000rpm短暂离心(不超过1分钟)，取上清10微升作模板(即0.2微克DNA)加入一对引物各20pmol，dNTP200毫微克，10×Buffer 5微升，再加双蒸水至50微升，放入PCR热循环仪中扩增95℃变性4分钟，待温度按程序自动降至70℃时取出，加入TaqDNA多聚酶1.2单位，然后继续以94℃变性40秒、55℃复性40秒、70℃延伸30秒为一个循环，共30个循环，最后72℃继续延伸7分钟。取经PCR扩增后的特异性DNA片段20微升，以SfaNI内切酶1个单位、2.3微升NEBuffer3置37℃水浴箱内消化6小时，取10微升加2％溴化乙锭电泳仪下分析，正常者呈现190bp、150bp两个片段，而Leber氏遗传性视神经病变患者因其DNA不能被SfaNI限制性内切酶切割而只呈现340bp一个片段。
本发明的有益效果是解决了以往只能靠家族遗传史来诊断Leber氏遗传性视神经病变的问题，为临床明确检测Leber氏遗传性视神经病变提供了一个简便、可靠的方法和试剂盒。
权利要求
1.一种临床检测Leber氏遗传性视神经病变的试剂盒，其特征在于由抗凝剂、溶血液、一对引物、dNTP、TaqDNA多聚酶、10×Buffer、SfaNI限制性内切酶、NEBuffer3各一管组成，具体为(1.1)特定抗凝剂EDTANa22gNaCl 0.85g加水至100ml(1.2)一对引物各一管5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′轻链POS.11641～11660，每微升500纳克。5GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重链POS.11980～11961，每微升500纳克。(1.3)dNTPdNTP 200毫微克；(1.4)TaqDNA多聚酶；TaqDNA多聚酶1.2单位(1.5)10×Buffer10×Buffer 5微升；(1.6)SfaNI限制性内切酶SfaNI(New England Biolabs产)(1.7)NEBuffer3NEBuffer3(New England Biolabs产)′(1.8)溶血液Tris-Hcl 10mmol/L.pH7.5NaCl 10mmol/L，MgCl25mmol/L。
2.一种临床检测Leber氏遗传性视神经病变的方法，其特征在于依次包括如下步骤(2.1)抽取患者外周静脉血1毫升，加入特定抗凝剂100微升中，轻轻摇匀，成抗凝血；(2.2)取抗凝血50微升置于400微升溶血液中轻轻摇匀，静置5分钟，经4000rpm离心5分钟后弃上清，加入100微升生理盐水混匀，置100℃沸水7分钟，4000rpm短暂离心，取上清10微升作模板；(2.3)模板10微升中加入一对引物各20pmol，dNTP200毫微克，10xBuffer 5微升，再加双蒸水至50微升，置PCR热循环仪中循环95℃变性4分钟，待温度按程序自动降至70℃时取出，加入TaqDNA多聚酶1.2单位，然后继续以94℃变性40秒、5 5℃复性40秒、70℃延伸30秒为一个循环，共30个循环，最后72℃继续延伸7分钟，成为经PCR扩增后的特异性DNA片段；(2.4)取经PCR扩增后的特异性DNA片段20微升，以SfaNI内切酶1个单位和2.3微升NEBuffer3置37℃水浴箱内消化6小时；(2.5)取步骤(2.4)中最后生成物10微升，加2％溴化乙锭，在电泳仪下分析，正常者呈现190dp、150dp两个片段，而Leber氏遗传性视神经病变患者只呈现340dp一个片段。
全文摘要
本发明是一种临床检测Leber氏遗传性视神经病变的方法及其试剂盒。根据本病患者存在线粒体点突变致使正常线粒体DNA中限制性内切酶SfaNI识别位点丧失的特点，利用特定的抗凝剂、溶血液和一对引物，经PCR扩增后的产物不能被SfaNI限制性内切酶消化切割而检测本病。本发明的有益效果是解决了以往只能靠家族遗传史来诊断Leber氏遗传性视神经病变的问题，为临床明确检测本病提供了一种简便、可靠的方法和试剂盒。
文档编号C12Q1/00GK1143117SQ9611629
公开日1997年2月19日 申请日期1996年4月1日 优先权日1996年4月1日
发明者周海林, 邹祝英, 胡育新 申请人:中国人民解放军第二军医大学