专利名称：重组人nadh脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
Leber 遗传性视神经病变(Leber，s hereditary optic neuropathy, LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。LHON由线粒体位点突变引起，我国学者已初步确认中国95%以上的LHON患者分别与线粒体DNA11778U4484和3460的位点突变有关，其中111778位点突变最常见，占我国LHON的8 9. 2 %，且预后最差。线粒体D NA 117 7 8位点突变的发病机制是，线粒体DNA(mtDNA)第11778核苷酸发生突变引起的，即鸟嘌呤(G)—腺嘌呤(A)，此突变使呼吸链上NADH脱氢酶亚单位4中(ND4)基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LH0N。LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中的ND4异常所致。国外的研究中也有人使用这一技术，但国外研究中设计的核酸序列都加入了绿色荧光蛋白(GFP)，这样的核酸序列可以用于实验研究，无法使用到人的治疗中。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因。本发明的第二个目的是提供一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。本发明的第三个目的是提供重组腺相关病毒rAAV2/2_ND4在兔子中的临床应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的重组人NADH脱氢酶亚单位4基因，其核苷酸序列SEQ ID NO :1所示，其大小为2889bp。自Ibp至1464bp区段为其开放阅读框，起始于密码子ATG，编码487个氨基酸，其中前面的84个核酸是C0X10的一段序列，编码28个氨基酸的肽链，其功能是引导ND4蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能，后面的1380个核酸编码ND4的459个氨基酸加上3个终止密码子，这1380个核酸是在细胞核里编码ND4的459个氨基酸，与目前公开发表的在 线粒体里面编码ND4的核酸序列不同；3’非编码区长为1425bp的C0X103’ UTR0 重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括(一 )、含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建将权利要求I所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO : I加Kpn I和SalI两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组 pSNaV/ rAAV2/2-ND4。(二)、rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒包被 I)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm2细胞培养瓶中，接种密度3. OX 107个ZmL细胞，培养基为DMEM+10%牛血清，置37°C含5% CO2的培养箱中培养过夜。2)、转染当天换液，用新鲜的含10%牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80 90%时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV_r2c5、pSNaV_ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在I. 5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10 15min ；(b)将A试剂同30mL DMEM+10%牛血清混合均匀，编号为B试剂；(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37°C含5% CO2的培养箱中继续培养；(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10%牛血清)。3)、转染48h后，收取细胞。4)、将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。( 二 ) rAAV2/2-ND4病毒的纯化与浓缩采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV2/2_ND4病毒。(三)rAAV2/2_ND4的目的基因的PCR鉴定取IOuL重组rAAV2/2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取IuL作为模板，所述特异性引物为IF :5，-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3，；1R:5， -GAGGAA A ACCCGGTAATGATGTC-3，；(四)、rAAV2/2-ND4的滴度测定标记探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND4的物理滴度。本发明的具有如下优点和显著的进步该核苷酸序列SEQ ID NO 1通过与腺病毒载体重组后转染视网膜细胞，进入其核染色体内，并在胞液中表达出正常的蛋白质-ND4蛋白，该蛋白N末端有信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，被蛋白酶水解后，成熟的ND4蛋白进入线粒体发挥作用。因此，通过构建rAAV2/2-ND4，制备玻璃体腔注射的药物，用于研究该基因在LHON的基因治疗中的作用。
图I为重组腺相关病毒中的ND4目的基因；图2为构建好的pSNaV/rAAV2/2_ND4载体图3为重组腺相 关病毒中的浓缩检测图；图4为用PCR检测重组腺相关病毒中的ND4目的基因；图4中，M Maker，I :目的片段,2 :阳性对照，3 :阴性对照；图5为用检测重组腺相关病毒中的ND4目的基因的测序图；图6为rAAV2/2_ND4的滴度测定结果；图7为实验组和对照组的眼底照相结果；图 7 中，A 为 rAAV-GFP 组，B 为 rAAV_ND4 组；图8为视网膜荧光照相的结果显示；图8 中，A 为 rAAV-GFP 组，B 为 rAAV_ND4 组；图9为视网膜免疫荧光的结果显示；图9 中，A 为 rAAV-GFP 组，B 为 rAAV_ND4 组；图10为Western blot检测ND4蛋白的表达图；图11为OCT检测示意图；图11 中，A 为 rAAV-GFP 组，B 为 rAAV_ND4 组。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I一、试验材料表I
权利要求
1.重组人NADH脱氢酶亚单位4基因，其核苷酸序列SEQID NO :1所示，其大小为2889bp0
2.如权利要求I所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括 (一)、含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建 将权利要求I所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO 1加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组 pSNaV/rAAV2/2-ND4 ； (二)、rAAV2/2-ND4重组腺相关病毒包被 1)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm2细胞培养瓶中，接种密度3.OX 107个/mL细胞，培养基为DMEM+10%牛血清，置37°C含5% CO2的培养箱中培养过夜； 2)、转染当天换液，用新鲜的含10%牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80 90%时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为 (a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV_r2c5、pSNaV_ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在I. 5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10 15min ； (b)将A试剂同30mLDMEM+10%牛血清混合均匀，编号为B试剂； (c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37°C含5%CO2的培养箱中继续培养； (d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10%牛血清)； 3)、转染48h后，收取细胞； 4)、将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次； (二)rAAV2/2-ND4病毒的纯化与浓缩 采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV2/2-ND4病毒； (三)rAAV2/2-ND4的目的基因的PCR鉴定 取IOuL重组rAAV2/2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取IuL作为模板， 所述特异性引物为IF :5’ -ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’ ；1R:5’ -GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’ ； (四)、rAAV2/2-ND4的滴度测定 标记探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND4的物理滴度。
3.权利要求2的所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体中所构建的重组腺相关病毒载体pSNaV/rAAV2/2-ND4。
4.权利要求2的所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体中所获得的含有PSNaV/rAAV2/2-ND4载体的菌株。
5.权利要求2所述的重组腺相关病毒rAAV2/2-ND4在兔子中的临床应用。
全文摘要
本发明公开一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，其核苷酸序列SEQ ID NO1所示，其大小为2889bp。腺相关病毒载体的构建步骤如下先构建含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体，然后重组腺相关病毒包被、转染、纯化、浓缩、鉴定。该方法能快速，简便地构建携带重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。该基因可以用于LHON的基因治疗。
文档编号C12N15/66GK102634527SQ20121010433
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者万幸, 李斌, 裴晗 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院