专利名称：昆虫杆状病毒表达抗肿瘤Onconase蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产重组蛋白类药物技术领域。
背景技术：
昆虫杆状病毒表达系统最早由Maeda于1985年开发出来的。由于该系统潜在的 巨大优势，为生产人类急需的蛋白类药物，基因工程疫苗和基因工程杀虫剂等提供了崭新 的途径，因而近几十年来受到广泛的重视。杆状病毒(baculovirus)是昆虫病毒中的最大的一种病毒，可分为3个亚群核型 多角体病毒(NPV)，颗粒状病毒(GV)；非包涵体型杆状病毒(NOV)。核型多角体病毒又分单 核衣壳NPV (SNPV)和多核衣壳NPV (MNPV)，如家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿尺蠖核型 多角体病毒AcMNPV。昆虫生物反应器表达载体系统与大肠杆菌，酵母和哺乳动物细胞表达系统相比具 有以下优点(1)安全性好。杆状病毒是昆虫或节肢动物病毒，对人畜无害，外源基因插入 多角体蛋白基因位点引起其缺失或失活，因此重组病毒不能产生包涵体，而且重组病毒不 能像野生病毒那样在环境中长期存在，在自然界生存能力弱，所以更安全。(2)表达产物后 加工比较完全。该表达系统属于真核表达系统，表达产物能进行糖基化，磷酸化，脂肪酸化， 酰胺化，切割信号肽和形成三级或四级高级结构，因此在结构、生物活性、抗原性和免疫性 等方面与天然蛋白有很强的相似性。(3)可容纳较大的外源DNA片段。杆状病毒约130kb 基因组的DNA可容纳IOkbp的外源片段DNA的插入，且不影响病毒的复制及装配。(4)适合 表达细胞毒性蛋白，应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使表达产物是细胞 毒性蛋白，也不影响表达水平，因为在这些有毒产物表达之前，病毒已完成复制并释放出大 量成熟的子代毒粒，不会干扰病毒的复制。(5)借助多元表达载体，可以同时表达2种或多 种外源蛋白，便于研究肽链的装配和蛋白寡聚体的结构和功能。(6)杆状病毒表达载体通用 性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含 子的外源基因。(7)高效表达。多角体基因和ρ 10基因都是病毒在细胞中复制的非必需基 因，可以被外源基因取代，而这两个晚期基因启动子功能都很强大，外源基因表达量往往是 其他系统的几十甚至是几百倍。(8)蚕体中有多种天然蛋白保护剂，对表达产物有保护作 用，使基因产物十分稳定。(9)以蚕作为生物反应器，具有我国资源优势和特色，容易形成自 主产业。(10)宿主家蚕是目前在世界上了解最清楚，生物学背景最明确的经济昆虫，可以低 成本，大规模饲养。重组BmNPV载体的构建目前，用于构建BmNPV的载体有两类，一类是单独表达外源基因(即非融合基因) 的载体，另一类是以融合基因(即部分多角体蛋白编码序列与外源基因连接)形成的表 达载体。这些载体通常含有多角体蛋白基因前后各约3kbp的序列，此两片段间含有外源 基因插入的多克隆位点，抗生素抗性基因和细菌质粒的DNA复制起点。家蚕BmNPV表达系 统是利用多角体蛋白基因启动子及其他一些基因元件构建转移载体(transfer vector),将外源基因插入多角体蛋白基因启动子(Ph)下游形成重组质粒，再和亲本病毒共转染 (co-transfection)家蚕细胞，外源基因将通过胞内同源重组置换出多角体蛋白基因，然后 通过空斑筛选等方法分离、纯化出重组病毒。主要方法是磷酸钙介导转染法。磷酸钙介导转染法将BmNPV细胞接种于适当的血清培养液中进行单层培养，然 后将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上的培养液中混合培养20-24h，除去上清液，收集培 养物用于空斑筛选。将2 X IO6对数期生长的BmNPV细胞接种于60mm的培养皿中，2h后吸去 培养基，加入IML上述共转染稀释液，27°C培养lh，除去病毒感染液，然后铺一层含Sea plaque的TC2100培养液凝胶(45 50°C )待其凝固后，28°C培养4 6天，在倒置显微镜 下观察空斑，将无多角体的空斑挑出，经多次重复筛选，就可得到全部空斑均无多角体的重 组病毒。应用家蚕杆状病毒表达系统生产有用蛋白的操作步骤重组BmNPV经过构建并进行鉴定确认后，即可通过以下操作步骤生产对我们人类 有用的蛋白。幼蚕的挑选及处理采用五龄家蚕幼虫，在注射重组BmNPV前必须经过严格挑选，除去状况不好的幼 蚕以减少注射后的细菌感染，用消毒棉签沾0.3%的漂白粉或消特灵对蚕身进行消毒，然后 晾干备用。注射重组BmNPV选取消过毒的幼蚕节间膜处，以接种针注射5μ 1重组BmNPV，注射后放置在周转 箱内，室温保存。重组BmNPV的繁殖注射后的幼蚕在25°C下保护4 5天，让重组病毒充分繁殖。由于注射后的幼蚕 不可避免地要发生一些坏死或败血的现象，因此在注射后的第2 4天，要及时剔除坏死或 败血的幼蚕。重组BmNPV感染幼蚕的收藏重组BmNPV注射到幼蚕体内后4 5天，重组病毒在幼蚕体内得到充分繁殖，目的 蛋白得到充分表达，此时可进行收集。收集时，将盛放幼蚕的周转箱放置于_18°C左右的冰 柜中，或者冷冻24小时，直到蚕体完全冻硬为止。然后，集中放置在冷库中冻存备用。肿瘤一直是危害人类健康的一大疾病，近年来发病率一直在上升，目前，人类还没 有非常有效的治疗肿瘤的方法，一些用于治疗肿瘤的药物由于毒副作用大而效果不理想， 限制了药物的使用，寻找一种高效的抗肿瘤药物一直是抗肿瘤研究的热点。广泛存在机体内的核酸酶是一类序列保守，结构稳定，以RNA为底物的蛋白，它们 具有的抗肿瘤特性引起了大家的兴趣，特别是由于它们和机体内源性蛋白相似，分子量小， 作为抗肿瘤药物，它们具有免疫源性弱，毒副作用小等优点。九十年代在两栖类蛙卵(Rana pipiens)内发现的核酸酶-Onconase的抗肿瘤效果目前在核酸酶家族中是最好的，在体内 外试验中，Onconase对一系列肿瘤都有明显的治疗效果，作为抗肿瘤药物有很大的潜力。我 们的研究主要是用昆虫杆状病毒通过基因重组来生产出Onconase。Onconase 结构特点Onconase核酸酶是由104个氨基酸组成，分子量为12kd。
Onconase的N端和C端结构都比较特殊，对Onconase酶活性和稳定性影响很大。 N端第一个氨基酸谷氨酰胺在天然蛋白中自动环化为焦谷氨酰胺，将N端封闭。C末端的 Cysl04和Cys90形成一对二硫键将C末端封闭，另外，分子内还有3对二硫键对稳定蛋白结 构起很大作用。Onconase这种特殊结构使它异常稳定，Tm高达90°C，并能抵抗蛋白酶的水 解作用。Onconase 的酶活性Onconase的活性中心位于N端的α螺旋和两组“V”字型交叉的β折叠构成的凹 槽中，Lys9, HislO, Lys31, His97, Phe98都是酶活性中心的组成部分，N端的焦谷氨酰胺通 过氢链和Lys9相互作用，也是酶活性中心的组成部分。Onconase抗肿瘤特性体外实验证明，Onconase对淋巴瘤细胞，肺癌细胞，肝癌细胞都有很好的杀伤作 用。不同生长状态的细胞对ONC毒性的敏感度不同，实验显示，ONC对处在指数生长期的 NIH/3T3细胞的毒性是处在非指数生长期的2. 5倍，NIH/3T3细胞被激活增殖信号通路后对 ONC的毒性更敏感。肿瘤细胞一般都是增殖异常的细胞，导致肿瘤细胞对ONC毒性更敏感。 治疗小鼠M109肺癌实验证明，ONC能明显延长实验组小鼠的存活时间。Onconase的抗肿瘤 作用和它的核酸酶活性直接相关，检测Onconase作用后的肿瘤细胞，发现胞内的tRNA被降 解。
发明内容
菌株和质粒pET22b (+)BL_21(DE3)菌株。试剂限制性内切酶，T4连接酶，rTAq、高保真耐热DNA聚合酶，胶回收试剂盒、BAD蛋白 浓度测定试剂盒，RnaseA, Transferrin, SPDP，酵母 tRNA，BSA, MTT, ECL。主要溶液Yeast ExtrastionNaclTryptoneTB 培养液(IL)Yeast ExtractionTryptoneGlycerolKH2PO4K2HPO4. 3H20CMB80 溶液(ΡΗ6· 4)CaCl2 · 2Η20MnCl2 · 4Η20
5
LB培养液(IL)
5g
IOg
IOg
LB富培养液(IL) 15g 7g 30g
24g 12g 4ml 2. 31g 12. 54g
11. 8g/L 4. Og/L
MgCl2 .6H202. 0g/L
KAC(1M,ΡΗ7.0) 10ML/L
Glycerol100ML/L
缓冲液
SSB_A20mMTris-HCl,IOmM EDTA,ΡΗ8.0
WIBBl20mMTris-HCl, ΡΗ8. 0 IOmM EDTA,2% Triton X-IOOand 2Μ urea, PH8. 0
WIBB220mMTris-HCl,IOmM EDTA,ΡΗ8.0
DIBB20mMTris-HC1,7M Guanidine-HCl,IOmM DTT，IOmM EDTA, ΡΗ8.0
DB20mM Acetic Acid
RBIOOmM Tris-AcoH,IOOmM Nac1,3. OmM reduced Glutathilone 0. 6mM
oxidized GlutathionePH8. OTBST IOmM Tris-Hcl, 150mM Nac 1,0. 05% Tween 20，PH7. 5ELISA 底物液(500ml PH5. 0) =Na2HPO4 · 12H20，8. 72g，柠檬酸，2. 72g显色液使用前Iml 底物液中加 3% H2O2 1 μ UTMB (6mg/ml in DMSO) 12. 5 μ 1家蚕细胞培养基TC-100TC-100干粉20. 4g，水溶解后定容至1000ml，调ΡΗ6. 15-6. 18,0. 22 μ m滤膜过滤除 菌，分别装于250ml医用瓶中，4°C贮存，使用前添加10%的胎牛血清。IX TC-100补加10% FBS用于常规BmNPV细胞培养，IX TC-100 (不含胎牛血清) 及2XTC-100 (补加20% FBS)用于共转染和空斑筛选。主要仪器蛋白凝胶电泳仪，转膜仪，凝胶成像仪，FPLC，PCR仪，分光光度计，冷冻离心机，酶 标仪，超声波破碎仪，二氧化碳细胞培养箱，冷冻干燥仪。高效感受态制备1、接种菌于LB培养液，37°C振荡培养过夜。2、第二天转接于LB富培养液，37°C振荡培养至0D600 = 1.03、冰浴 IOmin4、4°C 2000 转 15min 收集菌体5、1/3体积的CCMB80溶液悬浮菌体，冰浴20min6、4°C，2000 转，IOmin 收集菌体7、1/12体积的CCMB80重悬浮菌体，100 μ 1每管分装，液氮速冻，保藏于_80°C。质粒构建ONC全基因序列由博采公司合成(图1)以 ONC 为模板，5 ‘ 引物 CCCAGGACTGGCTGACTTTCCA，3 ‘ 弓丨物 AAAGTCGACTCAGCAAGAACCAACACC，用高保真DNA聚合酶扩增，产物经纯化后用Sal I酶切，1 % 琼脂糖电泳割胶回收酶切产物得到片断1，将质粒pET22B(+)分别用MscI，Sail酶切， 琼脂电泳回收大片断酶切产物得到片断2。将片断1和片断2用T4连接酶连接得到pONC。PCR扩增体系(30 μ 1) PCR扩增条件
ddH2019 ( μ )94。C4 (min)IOXProbest Buffer394°C1 (min)dNTP Misture (2.5raM each)2.460°C40 (sec)Primer(33uM)1/172 "C40(sec)_Template0.472 °C10(min)Probest DNA polymerase0.2
30cycles表达质粒的构建和鉴定利用Pl引物引入平端，P2引物引入SalI酶切位点。ONC基因通过MscI，SalI酶 切位点克隆在pET22b(+)质粒信号肽pelB后(图2、图3)利用pelB的阅读框表达融合蛋 白。通过测序证明基因序列和阅读框架正确(图4)，pONC表达质粒构建成功。
图1是Onconase全基因序列2是pET_22b (+)质粒表达图
图3是pONC构成的过程图4是pONC产生的顺序实施方式将含有质粒的E. coli BL-21 (DE3)菌种接种于LB固体培养基上，37 °C培养过夜。用灭菌牙签挑取单菌落接种到5ml的LB富液体培养基中，37°C振荡培养至0D600 =1. 0冰浴IOmin4°C，2000转，离心15min收集菌体1/3体积的CCMB80溶液悬浮菌体，冰浴20min4°C，2000转，10分钟收集菌体，重组转移质粒与线性化病毒DNA共转染。将生长状态良好的家蚕培养细胞铺于体积为50ML的小培养皿中，使细胞密度为 1 X 106, 27°C培养4 12小时使细胞完全贴壁；取A离心管加入重转转移载体质粒0NC，线性化病毒DNA，混勻。取B离心管加脂质体，混勻。将A和B混合均勻，室温放置15分钟。吸去培养瓶中已经贴壁细胞的上清，用无血清培养基TC-100洗两次。加入无血清培养基，将上述的混合液滴入，并轻轻“8字型”转动培养瓶，使混合液 均勻分布。27°C培养6 12小时以后，在培养瓶中补加等体积的2XTC-100 (2XFBS)培养 基，或者移去共转染液，加入1XTC-100(1XFBS)的新鲜培养液。27°C继续培养4 6天， 在显微镜中能观察到细胞出现感染症状。将共转染细胞的培养液转接另一瓶，生长状态良 好的细胞。待感染细胞破裂后，12000rpm收集上清，并分装置于4°C保存，用于重组病毒的 蹄选。重组病毒的筛选分别将1 2ml生长状态良好的1 X IO5个家蚕培养细胞接种于4个35mm培养皿中，27°C贴壁培养6 12小时。用完全培养基(TC-100,1XFBS)分别以10-3，10-4，10-5和10_6梯度释放病毒 液，吸去各培养皿中的培养基，分别加入各稀释梯度的病毒液lml，27°C培养1小时。吸去感染液，将预先保温于40 0C水浴中的2 %低融点琼脂糖和 2XTC-100 (2XFBS)培养基1 1体积比混勻后，在每个平皿中各铺入2ml混合液，待凝胶 凝固后将平皿倒置，27°C培养3 5天。期间间隔6小时需要在显微镜下观察，以防止多个 空斑融合成片。在显微镜下观察空斑出现后，用记号笔在小培养皿上做好记号，再在超净台上用 Tip头挑出单个的病毒空斑，释放于200ul的培养基中，取SOul接种于事先铺有BmN单层细 胞(100-150 μ 1细胞液)的96孔板中，并做好标记，继续培养3 4天，在出现明显感染症 状的孔中加入1μ lX_gal，27°C培养过液。挑选白色孔Onconase重组基因在家蚕体内的表达取五龄家蚕幼虫50头，用酒精擦拭注射部位，小心地把Onconase重组基因液注射 入幼蚕体内，尽量避免蚕体中的绿色体液流出，接种后，放在26 °C -28 °C，通风透光场所放 置。注射后的幼蚕在25°C下保护4 5天，让重组病毒充分繁殖。由于注射后幼蚕不可避 免要发生一些坏死或败血的现象，因此在注射后的第2 4天，要及时剔除坏死或败血的幼蚕。由于重组病毒是注射入幼蚕体内，幼蚕所吃的桑叶以及饲养环境都要严格消毒， 保证无菌。把产生Onconase重组蛋白的幼蚕用粉碎机勻浆成黏稠状液体，所得勻浆液以 6000r/min, 4°C，离心30分钟，取上清液用8层医用纱布过滤，收集滤液。按滤液的四倍体积，加入lmol/1柠檬酸缓冲液(PH5. 0)，充分搅拌2小时后， 6000r/min，4°C，离心30分钟，所得上清液用8层医用纱布过滤，收集滤液。滤液用6000r/min，4°C，离心30分钟，所得上清液用20mM，NH4HCO3透析去盐，冷冻 干燥收集蛋白，蛋白溶解于PBS，过分子筛柱，收集目的蛋白峰，调节蛋白溶液PH至5. 0，过 强阳离子交换柱，在PH5. 0下用0-2M Nacl梯度洗脱，收集目的蛋白，再经过脱盐处理，浓缩 得到纯的样品蛋白Onconase。
权利要求
权利要求用pONC和杆状病毒(BmNPV)来感染家蚕幼体。
1.权利要求用pONC和杆状病毒(BmNPV)来感染家蚕幼体。
2.根据权利要求1所述的用蚕来生产抗肿瘤药物Onconase的方法，其特征在于包括分离纯化Onconase 蛋白的方法。
3.根据权利要求1所述的用蚕来生产抗肿瘤药物Onconase的方法，其特征在于pONC构成的过程，pONC 产生的顺序、质粒pET22b(+)的构建。
4.根据权利要求1所述的用蚕来生产抗肿瘤药物Onconase的方法，其特征在于重转转移载体质粒ONC 和昆虫杆状病毒共转染的过程。
5.根据权利要求1所述的用蚕来生产抗肿瘤药物Onconase的方法，其特征于Onconase重组病毒的筛
全文摘要
昆虫杆状病毒表达抗肿瘤Onconase蛋白。本发明通过Onconase蛋白重组质粒通过多角体蛋白基因共转染，通过空斑法纯化，获得重组病毒，把重组病毒注入五龄幼蚕体内高效表达，来获得抗癌的0nconase蛋白。优点(1)高效表达；(2)表达产物后加工较完善。缺点(1)非连续性表达；(2)缺乏复合寡糖；(3)安全性问题还没有定论。
文档编号C12N9/22GK101988051SQ200910163340
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者李桂云 申请人:李桂云