p53R175H特异性核酸适配体及其筛选方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学领域，具体地，设及一种RNA适配体的筛选及应用，尤其设及 突变蛋白的特异RNA适配体筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] p53蛋白是已知的重要肿瘤抑制蛋白。p53蛋白存在有多个功能结构域，在p53蛋 白中间的核屯、区域，约为100-300位氨基酸处，有DNA结合结构域。该个结构域依据序列特 异性结合实现DNA与之结合。该个结构域被认为是实现p53功能最重要的结构域，因为之 后的研究进一步证实，多数与p53突变相关的肿瘤均是由于p53在该个核屯、结构域中发生 无义突变所致，而有超过一半的人类肿瘤与p53蛋白的突变有关。随着测序技术的发展，在 所有已知的人类癌症中的p53的突变种类就超过了 10000个。其中的95%W上的突变是发 生在上述的DNA结合结构域中。75%的突变是单个位点无义突变，而不是缺失、插入或者是 移位。所W我们一般认为在大多数的癌症中，P53主要是在核屯、结构域中W单个位点突变 的形式而存在。
[0003] p53的突变体P53R17甜已知在小鼠胚胎成纤维（ME巧细胞和胸腺细胞中不行使 p53野生型蛋白的功能，并且在肺癌细胞中存在抗调亡的获得性功能。同时，P53R175H比其 他的任何一种p53蛋白的突变体具有更强的细胞群落形成能力，且发现在前列腺细胞中的 迁移能力也得到进一步加强。在临床研究当中，因为P53R17甜突变而造成的癌症患者中， 其临床治疗效果也是最不理想的。
[0004] 目前对于p53突变蛋白的治疗手段有限，效果较差。并且药物用量高，毒副作用 大。而解决方法除了开发新药外，祀向治疗成为了最主要的方法。此外，对于治疗后复发的 病人，目前缺乏有效的祀向诊断措施，难W判断肿瘤复发的部位和位置，使临床医生选择合 理的治疗方案非常困难。目前，缺乏高度特异的祀向介质，是制约针对p53蛋白突变的祀向 诊断和治疗发展的瓶颈。
[0005] 核酸适配体，是与抗体功能类似的单链寡核巧酸分子，可特异性识别包括金属离 子、有机小分子、多肤、蛋白质、细胞等多种祀标。它具有亲和力与抗体相当甚至更高、分子 量小、无免疫原性、合成方便且批次差异小、化学性质稳定等优点。因此核酸适配体在生物 监测、疾病诊断和祀向治疗方面具有广阔的前景。目前，世界上尚无能够特异性针对突变蛋 白的特异RNA适配体的报道。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性，分 子量小，化学性质稳定，易于保存和标记的可用于识别突变蛋白的核酸适配体及其衍生物。 本发明还相应地提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种核酸适配体（在本文中也被 称为P53R175H-APT)，所述核酸适配体的核巧酸序列包含W下RNA序列：
[000引 5 ' -GCAAUGGUACGGUACUUCCAUUAGCGCAUUUUAACAUAGGGUGCCAAAAGUGCACGCUACUUUG-3 '(SEQIDNO. 1)
[0009] 在本发明的另一个方面中，作为对上述技术方案的改进，可选择地，对上述核酸适 配体的核巧酸序列上的某一位置进行磯酸化、甲基化、氨基化、琉基化或同位素化。
[0010] 在本发明的另一个方面中，作为对上述技术方案的改进，可选择地，在上述核酸适 配体的核巧酸序列上连接巧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材 料或酶标记。
[0011] W上所述的经部分取代或经过修饰后的所述核巧酸序列，都具有原核酸适配体基 本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于识别P53R17甜蛋白并部分回复其 野生型功能。
[0012] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的核 巧酸序列包括W下S种序列中的任意一种：
[0013] (1)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核巧酸序列的同源性在60%W上 的序列（例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核巧酸）；
[0014] (2)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核巧酸序列能够进行杂交的序列；
[0015] (3)由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核巧酸序列反转录的DNA序列。
[0016] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体衍生物，所述衍生物是 前述所有技术方案中所述核酸适配体的核巧酸序列的骨架衍生出的硫代磯酸醋骨架，或者 是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肤核酸。
[0017]W上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体 基本相同或类似的分子结构，理化性质和功能，即都可应用于识别P53R17甜蛋白并部分回 复其野生型功能。
[0018] 另一方面，本发明还提供了一种如前述核酸适配体的筛选方法，包括W下骤：
[0019] (1)合成W下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
[0020] 随机单链DNA文库；TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25) CAAAAGTGCACGCTACTTTG
[0021] 5,端引物；5' -TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(沈QIDNO. 2)
[0022] 3,端引物；5, -CAAAGTAGCGTGCACTTTTG(SEQIDNO. 3)
[002引 似体外转录；W单链DM文库为模板，进行PCR扩增制备体外转录模板。将W上 PCR产物投入体外转录体系中，经过一段时间解育，纯化步骤，得到用于筛选的RNA适配体 文库；
[0024] (3)固相偶联蛋白：将p53野生型蛋白偶联在N服活化的琼脂糖珠子上。将 P53R17甜蛋白偶联在N服活化的磁珠上，用于下步差别竞争SELEX筛选步骤；
[00巧](4)差别竞争SELEX筛选；将步骤（3)中得到的偶联有特定蛋白的珠子加入步骤 似中得到的RNA适配体文库，经过37°C2小时解育，通过磁性分离只保留磁珠，并将依旧 结合在磁珠上的RNA适配体纯化、反转录，制备下一轮差别竞争SELEX筛选的文库；
[0026] (5)多轮筛选；将步骤4中得到的文库替代步骤（1)中的随机文库，并重复上述步 骤（2)~（4)的过程；每一轮筛选后通过化ISA方法检测文库分子对P53R17甜结合能力， 直至出现与祀标分子有高亲和力的RNA适配体后，将所得RNA适配体投入下游功能研究。
[0027] 第=方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物在制备检 测含有P53R175H的肿瘤的试剂盒、分子探针或祀向介质中的应用。
[0028] 第四方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物在设计和 制备治疗含有P53R17甜的肿瘤的药物中的用途
[0029] 与现有技术相比，本发明的优点在于；本发明的筛选方法可W用于筛选突变蛋白 特异的核酸适配体。将蛋白野生型与突变型分别偶联于不同的固相介质，让两种蛋白竞争 性地与文库中适配体结合，在结合过程中使得野生型与突变型的差别得W放大，进而筛选 出与突变蛋白亲和力更强的核酸适配体。本方法解决了微小差异祀标特异性低的问题，避 免了单一筛选方法带来的非特异性结合的不断积累，筛选效率更高；通过筛选得到的核酸 适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性且能够合成，分子量小，可W对不同部位进 行修饰和取代，且更稳定，易于保存。
[0030] 采用本发明的核酸适配体经实验验证，其对含有p53野生型的细胞无亲和力， 对P53R17甜有较高亲和力，并可W通过与祀标的结合，部分回复P53野生型功能，降低 P53R17甜细胞的生长速率、促进调亡、减慢迁移速率，具有一定的治疗效果。
[0031] 更具体地，本发明提供W下各项：
[0032] 1.特异性结合p53突变体蛋白P53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如 SEQIDNO. 1所示的序列。
[0033] 2.根据1所述的核酸适配体，其在SEQ ID NO. 1的某一位置处被修饰，如磯酸化、 甲基化、氨基化、琉基化或同位素化。
[0034] 3.根据1所述的核酸适配体，其还连接有巧光标记物、放射性物质、治疗性物质、 生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
[00巧]4.核酸适配体，其包含W下S种序列中的任意一种：
[0036] (1)与根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的序列同源性在60%W上的序 列；
[0037] (2)能够与根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列进行杂交的序列；或
[003引 （3)由根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列反转录的序列。
[0039] 5.根据1-3中任一项所述的核酸适配体的衍生物，所述衍生物具有由根据1-3中 任一项所述的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磯酸醋骨架，或者是由根据1-3中任 一项所述的核酸适配体改造成的相应的肤核酸。
[0040] 6.用于筛选特异性结合p53突变体蛋白P53R17甜的核酸适配体的方法，所述方法 包括W下步骤：
[0041] (1)提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包含由下式表示的随机单链DNA; TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG，其中N25 表示中 间的25个氨基酸的随机序列，并且提供如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示的一对引物； [004引 似W所述DNA文库为模板，使用上述引物进行PCR扩增，W所述PCR的产物作为 体外转录模板进行体外转录，从而获得用于筛选的RNA适配体文库；
[0043] (3)将野生型p53蛋白偶联在N服活化的琼脂糖珠子上，并且将突变体蛋白 P53R17甜偶联在N服活化的磁珠上；
[0044] (4)将步骤（3)中得到的偶联有p53的珠子和偶联有P53R17甜的磁珠加入步骤 (2)中得到的RNA适配体文库中进行解育，解育后对磁珠进行磁性分离，对结合在所述磁珠 上的RNA适配体进行纯化和反转录W制备用于进一步筛选的DNA文库；
[004引 妨用步骤（4)中得到的DNA文库代替步骤（1)中的文库来作为步骤似中的模 板，并重复步骤（2)至（4)，在每一轮筛选后比较所筛选到的RNA适配体与p53和P53R17甜 的结合能力，直至获得特异性结合P53R17甜的RNA适配体。
[0046] 7.根据6所述的方法，其中使用ELISA方法来比较所筛选到的RNA适配体对p53 和P53R17甜的结合能力。
[0047] 8.根据1-4中任一项所述的核酸适配体，或根据5所述的核酸适配体的衍生物，在 制备用于结合P53R17甜蛋白的试剂中的用途。
[0048] 9.根据1-4中任一项所述的核酸适配体，或根据5所述的核酸适配体的衍生物，在 制备药物中的用途，所述药物用于治疗由p53突变体P53R17甜引起的肿瘤。
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