[0234] 通过对存活细胞数量的检测，结果表明，筛选出的本发明的核酸适配体能够显著 降低含有P53R17甜的细胞生长速率。
[023引 4.AnnexinV-FITC_PI细胞调亡检测实验（图4b)
[0236] 本方法所用试剂盒为Vazyme公司的AnnexinV-FITC细胞调亡检测试剂盒（Cat. No.A211-02)〇
[0237] a.将已经处理过的细胞化1299-P53R175H)用不含邸TA的膜酶消化后300g，4°C 离屯、5分钟收集细胞。膜酶消化时间不宜过长，W防引起假阳性。
[023引 b.用预冷的PBS洗漆细胞两次，每次均在300g，4°C离屯、5分钟。收集1~5X105 细胞。
[0239] C.加入 100IXBindingBuffer重悬细胞。
[0240] d.加入 5y1AnnexinV-FITC和 5y1PIStainingSolution,轻轻混匀。
[0241] e.避光、室温反应10分钟。
[024引f.加入200y1IXBindingBuffer(试剂盒自带），轻轻混匀。样品在1小时内 用流式细胞仪或巧光显微镜检测。
[0243] 通过对调亡细胞数量的检测，结果表明，筛选出的核酸适配体能够显著促进含有 P53R175H的细胞调亡。
[0244] 4.p53免疫共沉淀实验
[0245] a.将化299-P53R17甜细胞（实施例4步骤2中获得的）铺在10cm细胞培养板中， 5%C〇2环境下37°C培养12-1她，待到细胞密度达到60-70%时利用LipofectAmine2000 体系分别转染P53R175H-APT和scramble,继续培养，直到转染后48小时后开始后续实验
[0246] b.细胞交联反应向细胞培养皿中滴加终浓度为0. 75%的甲醇，室温温和震荡10 分钟
[0247] C.加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，室温条件下温和震荡5分钟，W终止交联反 应
[024引 d.向细胞板中加入终裂解液（冰预冷）的60 %的体积将细胞洗下，再加入剩余 的40%体积从后到前洗漆细胞板，使之充分收集细胞。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充 分接触，裂解缓冲液RIPA;50mMhis-Cl[抑 8. 0]，150mM化Cl，5mM邸TA，1%NP-40,0.1% SDS(邸TA用化OH溶解）；
[0249]e. 4°C在垂直混合仪中裂解10分钟，
[0250] 将EP管放于冰上，利用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，超声程序为：超声3s，停 6s，功率30%，时间5分钟，4°C离屯、15分钟，将细胞破碎上清转移到另一个EP管中；
[0巧1] f.准备磁珠。取出一定量Dyn油eadsProteinG(Invitrogen)于EP管中。置于 磁力支架上，吸去保存液，
[0巧2] 抗体与ProteinG磁珠偶联将3yg左右p53抗体（cat#2524S，CellSi即aling Technology)稀释到200y1含有0. 02%Tween-20的PBS中，加入到步骤6中准备好的磁 珠，在室温条件下解育比左右，之后置于磁力支架上，吸取上清，用裂解缓冲液巧IPA)洗漆 3 次（1ml/ 次），
[0巧3] g.将步骤5得到的上清与此步骤7覆盖有抗体的ProteinG磁珠在室温条件下旋 转解育化，弃上清，用裂解缓冲液冲洗3次用提高盐离子浓度到250mM化C1的RIPA缓冲液 清洗，收集磁珠
[0巧4] h.加入1mlTRIzolRNA提取试剂进行RNA抽提纯化
[0巧引 5.TRIzol法RNA抽提
[0巧6] a.向得到的磁珠中加入1mlTRIzol,室温静置5分钟，使得介质均一化；
[0巧7] b.加入200y1氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；
[0巧8] C.4°C12000g离屯、15 分钟；
[0巧9] d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500 100%的异丙醇，室温放 置10分钟；
[0260]e. 4°C12000g离屯、10 分钟；
[026Uf.弃上清，用75%己醇洗漆，4°C7500g离屯、5分钟；
[0262]g.弃上清，在室温中惊干，20y1DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。
[026引6.反转录
[0264]a.预变性体系与预变性
[026引RNA 500ng-lyg
[0266] GSP(基因特异引物）（0. 5yg/反应）lyl
[0267] 无核酸酶的水 加至10y1
[026引70°C5分钟，完成后马上置于冰上。
[0269] b.反转录体系与反转录
[0270]
[0271] 25°C5 分钟；42°C60 分钟；70°C15 分钟；4°C<：?。
[027引7.实时巧光定量PCR(图4c)
[027引按照W下体系加入
[0274]
[0275] 将W上体系溶液按每孔15ul的量加入到S个孔中。将整个反应板放于PikoReal 实时定量PCR检测系统（ThermoScientific)中。按W下程序进行实时巧光定量PCR
[0276]
[0277] 其中，变性与退火/延伸该两步共进行40个循环。
[027引对PCR数据进行分析。
[0279] 在本实验结果中，无论是WIgG作为对照（图4c左）还是Wscramble序列作为 对照（图4c右），P53R175H-APT都显示出来对P53R17甜的高亲和力。
[0280] 实施例5、筛选得到的核酸适配体在裸鼠体内降低肿瘤生长速率
[0281] 1.实验动物购买及饲养
[0282] 13只5周龄雌性裸鼠均购于上海斯莱克（SLAC)实验动物有限公司，通过空运 抵达合肥，随后W每3只为一笼，饲养于中国科学技术大学实验动物中屯、II区。所有实 验动物操作流程均按照化tionalInstitutesofHealthGuidefortheCareandUse ofL油oratoryanimals进行，并经中国科学技术大学实验动物伦理委员会批准，批准号 No.USTCACUC1401008 (实体瘤注射治疗），No.USTCACUC1401010 (静脉注射治疗）。
[0283] 2.肿瘤接种
[0284] 在每只裸鼠背部皮下接种肿瘤。将准备好的H1299-P53R17甜细胞用膜酶消化 并计数，将细胞悬浮并加等量的Matrigel炬0Biosciences)混合，使得终浓度为5X106个 /lOOyl。在左右背部各接种一个肿瘤。
[0285] 3.给药方式与肿瘤测量
[0286] 实验动物抵达饲养间一周后接种肿瘤，5天后当肿瘤已可通过触感摸到时给药。实 体瘤注射为每个肿瘤部位注射lOygP53R175H-APT。静脉注射治疗是通过尾静脉注射，每 只裸鼠直接注射20ygP53R175H-APT。
[0287] 对于肿瘤每周使用游标卡尺测量两次，计算公式为V(in皿3)二aXb2/2,其中，a 为长径，b为短径。
[028引实验结果经分析，无论是通过实体瘤注射（图5a)还是静脉注射（图化），P53R175H-APT均能显著降低肿瘤生长速率，起到良好的治疗效果。
【主权项】
1. 特异性结合P53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO. 1所示的序列。2. 权利要求1所述的核酸适配体，其在SEQ ID NO. 1的某一位置处被修饰，如磷酸化、 甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。3. 权利要求1所述的核酸适配体，其还连接有荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、 生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。4. 核酸适配体，其包含以下三种序列中的任意一种： (1) 与权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的序列同源性在60%以上的序 列； (2) 能够与权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列进行杂交的序列；或 (3) 由权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列反转录的序列。5. 权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的衍生物，所述衍生物具有由权利要求 1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是由权利要 求1-3中任一项所述的核酸适配体改造成的相应的肽核酸。6. 用于筛选特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体的方法，所述方法包括 以下步骤： (1) 提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包含由下式表示的随机单链DNA :TAATACGA CTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC (N25) CAAAAGTGCACGCTACITTG，其中 N25 表示中间的 25 个 氨基酸的随机序列，并且提供如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的一对引物； (2) 以所述DNA文库为模板，使用上述引物进行PCR扩增，以所述PCR的产物作为体外 转录模板进行体外转录，从而获得用于筛选的RNA适配体文库； (3) 将野生型p53蛋白偶联在NHS活化的琼脂糖珠子上，并且将突变体蛋白p53R175H 偶联在NHS活化的磁珠上； (4) 将步骤（3)中得到的偶联有p53的珠子和偶联有p53R175H的磁珠加入步骤（2) 中得到的RNA适配体文库中进行孵育，孵育后对磁珠进行磁性分离，对结合在所述磁珠上 的RNA适配体进行纯化和反转录以制备用于进一步筛选的DNA文库； (5) 用步骤（4)中得到的DNA文库代替步骤（1)中的文库来作为步骤（2)中的模板，并 重复步骤（2)至（4)，在每一轮筛选后比较所筛选到的RNA适配体与p53和p53R175H的结 合能力，直至获得特异性结合P53R175H的RNA适配体。7. 权利要求6所述的方法，其中使用ELISA方法来比较所筛选到的RNA适配体对p53 和P53R175H的结合能力。8. 权利要求1-4中任一项所述的核酸适配体，或权利要求5所述的核酸适配体的衍生 物，在制备用于结合P53R175H蛋白的试剂中的用途。9. 权利要求1-4中任一项所述的核酸适配体，或权利要求5所述的核酸适配体的衍生 物，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由P53突变体p53R175H引起的肿瘤。
【专利摘要】本发明公布了一种特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明还公开了所述核酸适配体的衍生物以及所述核酸适配体的筛选方法及其在肿瘤治疗中的用途。
【IPC分类】G01N33/574, A61P35/00, G01N33/68, A61K31/7088, C12N15/10, C12N15/115
【公开号】CN104988156
【申请号】CN201510454876
【发明人】单革, 陈亮
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月27日