附图说明】
[0049] 图1显示本发明实施例的筛选流程图。
[0050] 图2显示本发明实施例的亲和力筛选流程及检测情况
[0051] 图3显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体与p53野生型的亲和力。
[0052] 图4显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体与P53R17甜的亲和力W及对细胞 的影响。
[0053] 图5显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体在裸鼠体内降低肿瘤生长速率。
【具体实施方式】
[0054] 提供W下实施例W便更好地理解本发明，而非限制本发明。W下实例中的实验方 法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生 化试剂商店购买所得。
[005引 W下实施例中使用到W下细胞：肥K293T(ATCC'tiC化-3216?)， NCI-H1299(ATCX：⑩邸L-5803?)。
[0056] 本发明利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，WP53R17甜为祀标，同时加 入p53野生型蛋白竞争筛选，从体外合成的随机寡聚RNA文库中筛选出与所述细胞株特异 结合的核酸适配体。
[0057] 本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何其 他来源的同样的序列。
[0058] 本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核巧酸的全部都相同的 序列。
[0059] 本发明中，可W对核酸适配体进行修饰或改造，得到所述核酸适配体的衍生物，所 述核酸适配体的衍生物可为：
[0060] a)将所述核酸适配体删除部分或增加部分互补的核巧酸，得到的与所述核酸适配 体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0061] b)将所述核酸适配体进行核巧酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适配体具有 相同功能的核酸适配体衍生物；
[0062] C)将所述核酸适配体的骨架改造为硫代磯酸醋骨架，得到的与所述核酸适配体具 有相同功能的核酸适配体衍生物；
[0063] d)将核酸适配体改造为肤核酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适 配体的衍生物；
[0064] e)将上述核酸适配体连接上巧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记 等物质后，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。
[0065] 本发明所述序列的祀标在化299细胞中不表达，本例使用的是化299-P53R17甜稳 转细胞系。
[006引 实施例
[0067] 实施例1、核酸适配体的筛选
[0068] 1.随机核酸文库的设计与合成
[0069] 设计合成如下所示单链DNA，其中间包括25个核巧酸的随机序列，其组成核酸序 列文库
[0070] TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG
[0071] 2.蛋白偶联固相载体
[0072] 2. 1.将P53R17甜蛋白（Cat.No.AZ-026Abzyme，氨基酸序列如SEQIDNO. 4 所示） 偶联到N服活化的磁珠（28-9940-09GEHealthcare)上。
[0073] 将适量磁珠从原管中放入新的EP管中，置于磁力架上，移走原来的储存液；
[0074]加上500y1冰预冷的平衡液（ImM肥1 (冰冷的）），混匀，移走平衡液；
[00巧]平衡后马上加入10yg蛋白，在结合缓冲液（0. 2MNaHC〇3, 0. 5M化C1，pH8. 3)环 境中重悬磁珠，在垂直混合仪上解育15分钟；
[0076] 置于磁力架上，移除上清液，进入到清洗封闭步骤；
[0077] 力日500y1封闭缓冲液M0. 5M己醇胺，0. 5M化化抑8.如，移除上清；
[007引力日500y1封闭缓冲液B(0. 1M己酸钢，0. 5M化C1，抑4. 0)，移除上清；
[007引力日500y1封闭缓冲液A，垂直混合解育15分钟；
[0080]加 500y1封闭缓冲液B，移除上清；
[0081 ]加 500y1封闭缓冲液A，移除上清；
[00的]加 500y1封闭缓冲液B，移除上清；
[008引 力日500y1结合缓冲液巧OmMTris，150mM化C1，抑7.W，并放于4°C保存。
[0084] 2. 2.p53野生型蛋白（Cat.No.AZ-025,其氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示）偶联 到N服活化的琼脂糖珠子（Cat.No.SF024-NHS,Sangon)上。
[0085] 将适量磁珠从原管中转移到新的EP管中，lOOOg离屯、1分钟，移走原来的储存液； [008引加 500y1纯水，lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[0087]加 500y1 结合 / 洗漆缓冲液（0. 1MSodium曲osphate, 0. 15M化C1，pH7. 2(PBS))，lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[008引加蛋白溶液（lOug)，垂直混合仪上室温解育比；
[0089] lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[0090]1ml结合/洗漆缓冲液清洗，lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[0091] 重复f;
[0092] 加500y1封闭缓冲液（IM己醇胺，pH7. 4)，垂直混合仪上解育15-20分钟；
[009引lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[0094] 1ml上述结合/洗漆缓冲液清洗，lOOOg离屯、1分钟，移除上清；
[0095] 将蛋白最终重悬在500 yl SHMCK缓冲液（20mM肥阳S抑7. 35, 120mM化Cl，5mM KC1, ImM CaCl2, ImM MgCy里，放于4°C保存。
[0096] 3.体外转录RNA
[0097] a.W合成的初始DM库为模板，加入到如下PCR体系中；
[0098]
[0099] 反应程序为；
[0100] 98 °C预变性5分钟，98 °C变性30s，55 °C退火3s，72 °C延伸10s，共25个循环， 72°C10分钟，4°C终止反应。
[0101] b.跑胶验证产物纯度
[010引 配置12%化tivePAGE胶
[0103]
[0104] 取出加1PCR产物，加上lul6X上样缓冲液，上样，200V稳压跑胶。
[010引 C.WPCR产物为模板，进入到如下体外转录体系：
[0106]
[0107] 37°C她解育。
[0108] d.往体外转录体系中加入2y1面aselW移除DNA模板。
[0109] e.往体外转录体系中，加入15 y 1 3M NaAc抑5. 2,115 y 1无RNA酶纯水，混匀。
[0110] f.加入等量体积的酪氯仿溶液，充分震荡混合，12000rpm离屯、1分钟，取上清并转 移到另一个干净的EP管中。
[0111] g.加入等体积氯仿，充分震荡混合，12000rpm离屯、1分钟，取上清并转移到另一个 干净的EP管中。
[0112] h.加入2倍体积冰己醇，-80°C静置至少30分钟。
[0113] i. 4°C 12000巧m离屯、15分钟，弃上清。
[0114] j.加入1ml 75%己醇清洗，4°C 12000巧m离屯、10分钟，弃上清。
[011引k.室温充分惊干，50y1无RNA酶纯水溶解，测定浓度，-80°C保存。
[0116] 4.竞争性筛选
[0117] 将偶联有p53野生型的琼脂糖珠子和偶联有P53R17甜的磁珠各取出lyg，用 SHMCK缓冲液（20mM肥阳SpH7. 35, 120mMNaCl, 5mMKC1,ImMCaCl2,ImMMgCla)清洗一次， 之后同时投入到上述体外转录的RNA库（lug)中进行解育，总解育体系500yl，37°C震荡 解育。当经过了 2个小时的震荡解育后，通过磁力架将偶联有P53R17甜的磁珠单独保留下 来，加入1mlTRIzolRNA抽提试剂（Ambion)进行磁珠上RNA抽提。
[011 引5. TRIzol法RNA抽提
[0119] a.向得到的磁珠中加入1ml TRIzol,室温静置5分钟，使得介质均一化；
[0120] b.加入200y1氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；
[0121] C.4°C12000g离屯、15 分钟；
[0122] d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500 100%的异丙醇，室温放 置10分钟；
[012引e. 4°C 12000g离屯、10分钟；
[0124]f.弃上清，用75%己醇洗漆，4°C7500g离屯、5分钟；
[01巧]g.弃上清，在室温中惊干，20 DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。
[0126] 6.反转录
[0127] a.预变性体系与预变性
[012引 RNA 500ng-lyg
[0129] GSP(基因特异引物）（0. 5yg/反应）lyl
[0130] 无核酸酶的水 加至lOyl
[0131] 70°C5分钟，完成后马上置于冰上。
[0132] b.反转录体系与反转录
[0133]
[0134] 25°C5 分钟；42°C60 分钟；70°C15 分钟；4°C。
[0135] 7.PCR扩增下一轮RNA库的模版
[0136] W上述得到的cDNA作为模板，加入到如下PCR体系中；
[0137]
[013引反应程序为：
[0139] 98 °C预变性5分钟，98 °C变性30s，55 °C退火3s，72 °C延伸10s，共25个循环， 72°C10分钟，4°C终止反应。
[0140] 8.多轮筛选
[0141] 将步骤7所得到的特异核酸适配体单链文库替代步骤3中DNA文库，继续重复上 述步骤2~7的操作过程。经过5轮筛选，在每轮筛选后，通过本领域技术人员所熟知的用 于检测核酸适配体与祀蛋白结合能力的测定方法（例如实施例2中所述的基于ELISA的 亲和力测定方法）对在本轮随机选取的序列进行亲和力测定，最终筛选得到具有如SEQID NO. 1所示的序列的核酸适配体。相对于p53野生型，所述序列的核酸适配体对于P53R17甜 的亲和力更高（近一个数量级差异）。
[0142] 所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，W增进筛选核酸适配体的富集程度。所述 增加筛选压力包括线性减少投入RNA量、祀标的用量和两者的解育时间。
[0143] 实施例2、基于ELISA的亲和力筛选方法
[0144] 本领域技术人员将理解核酸适配体与祀蛋白的结合能力可W通过不同于化ISA 方法的其他方法检测。
[0145] 1.T载体构建与藍白斑筛选
[0146]