a.按W下体系配置T载体连接体系：
[0147]
[014引 b.将连接产物转化入感受态细胞中；
[0149] C.在具有氨节抗性的LB板中，事先涂上lOOulIPTG和200ulX-Gal，放于37°C培 养箱惊干。再将低速培养过的感受态细胞均匀涂抹至板上，37°C培养12-16小时；
[0150] d.次日挑取白色克隆，培养细菌并送测序；
[0151] e.对测序成功的样本抽取质粒，用作下一步体外转录模板。
[0152] 2.体外转录带有生物素标记的RNA
[0153] a.使用AmpliScribe?T7-Flash?Bi〇tin-RNA"Transcription试剂盒 巧picentre)，按如下配方进行体外转录；
[0154]
[0156] 37°C1 小时
[0157] b.加入 1y1 (1MBU)面asel消化DNA模板，37°C30 分钟。
[0158] 3.酪氯仿抽提RNA
[0159] a.加入80y1无RNA酶纯水到W上体外转录体系；
[0160] b.加入同等体积的酪氯仿溶液，振荡15秒，4°C1200化pm离屯、5分钟，将上清取到 另一只管中；
[016。C.加入同等体积的氯仿溶液，振荡15秒，4°C 1200化pm离屯、5分钟，将上清取到另 一只管中；
[016引d.加入两倍体积冰己醇和10%体积的3M醋酸钢，-80°C静置30分钟W上；
[016引 e. 4°C 1200化pm离屯、15分钟，弃上清，保留沉淀；
[0164] f.加入1ml75 %己醇清洗，4°C1200化pm离屯、5分钟，弃上清，置于室温惊干；
[0165] g.加入50y1无RNA酶纯水溶解RNA沉淀，测量浓度，用于下步亲和力测试。
[0166] 4.ELISA亲和力测试（图2a)
[0167] a.在0.05M的碳酸钢溶液中配制p53和P53R17甜蛋白溶液（l-l〇yg/ml不等，根 据蛋白性质）；
[0168] b.每个小孔中加入0.lug上述蛋白溶液，用封口膜封住盖子，室温震荡解育化或 4°C过夜；
[0169] C.用PBST溶液洗漆小孔3次，最后一次将96孔板倒置在吸水纸上，W控干液体；
[0170]d.加入200y1封闭液（0. 5%BSA，PBST溶解），室温解育比或4°C过夜；
[0171]e.再用PBST清洗小孔S次；
[0172] f.加入体外转录的带有生物素标记的RNA，室温震荡解育1小时；
[017引g.PBST(NaCl8g，KC1 0. 2g，K&PCM0. 24g，化2册04. 12&0 2. 9g，加水到 1L体系， 抑7. 4)清洗小孔S次；
[0174] h.加上稀释过的AP标记的链霉亲和素100yl。用封口膜将盖子封闭，室温震荡 比；
[0175] i.再次用洗漆缓冲液洗漆非特异背景；
[017引 j.马上加入100y1底物（Img/ml对硝基苯磯酸二钢），避光解育30分钟；
[0177] k.向每个孔中加入100y1 3M化0HW终止反应。在酶标仪中读取405皿时的光 吸收。
[0178] 如图所示，在对第S轮和第四轮进行的亲和力测试中，相对于对p53野生型的亲 和力，暂未发现有对P53R17甜蛋白更具亲和力的候选适配体（图化）。但在第五轮结束后 进行的亲和力测试中，第3号候选适配体对P53R17甜的亲和力是对p53野生型的近10倍 (图2c)。故选定其进行后续研究，第3号候选适配体的核酸序列为SEQIDNO. 1。
[0179] 实施例3、筛选得到的核酸适配体对p53野生型蛋白无亲和力
[0180] 1.P53免疫共沉淀实验
[0181] a.将肥K293T细胞铺在10cm细胞培养板中，5%C02环境下37°C培养12-1她，待 到细胞密度达到60-70 %时利用LipofectAmine2000体系分别转染通过实施例1筛选到的 序列如SEQIDNO. 1所示的核酸适配体（P53R175H-APT)和scramble(其为随机负对照序 列GCAATGGTACGGTACTTCCGCCTGGCTGGTCTTTGAACTCTTTTCAAAAGTGCACGCTACTTTG)，继续培养， 直到转染后48小时后开始后续实验；
[0182] b.细胞交联反应：向细胞培养皿中滴加终浓度为0. 75%的甲醇，室温温和震荡10 分钟；
[0183]C.加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，室温条件下温和震荡5分钟，W终止交联反 应；
[0184] d.向细胞板中加入终裂解液（冰预冷）的60 %的体积将细胞洗下，再加入剩余 的40 %体积从后到前洗漆细胞板，使之充分收集细胞。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充 分接触，裂解缓冲液RIPA;50mMhis-Cl[抑 8. 0]，150mM化Cl，5mM邸TA，1%NP-40,0.1% SDS(邸TA用化OH溶解）；
[0185] e. 4°C在垂直混合仪中裂解10分钟，将EP管放于冰上，利用超声破碎仪对细胞进 行超声破碎，超声程序为：超声3s，停6s，功率30%，时间5分钟，4°C离屯、15分钟，将细胞 破碎上清转移到另一个EP管中；
[0186] f.准备磁珠；取出一定量Dyn油eadsProteinG(Invitrogen)于EP管中。置于磁 力支架上，吸去保存液，将抗体与ProteinG磁珠偶联，将3yg左右p53抗体（cat#2524S， CellSi即alingTechnology)稀释到 200y1 含有 0. 02%Tween-20 的PBS中，加入到准 备好的磁珠中，在室温条件下解育Ih左右，之后置于磁力支架上，吸取上清，用裂解缓冲液 (RIPA)洗漆 3 次（1ml/ 次）；
[0187] g.将步骤e得到的上清与步骤f覆盖有抗体的ProteinG磁珠在室温条件下旋转 解育化，弃上清，用裂解缓冲液冲洗3次用提高盐离子浓度到250mM化C1的RIPA缓冲液清 洗，收集beads;
[0188] h.加入1mlTRIzolRNA提取试剂进行RNA抽提纯化。
[0189] 2.TRIzol法RNA抽提
[0190] a.向得到的磁珠中加入1mlTRIzol,室温静置5分钟，使得介质均一化；
[0191] b.加入200y1氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；
[019引C.4°C12000g离屯、15 分钟；
[0193] d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500 100%的异丙醇，室温放 置10分钟；
[0194] e. 4°C12000g离屯、10 分钟；
[019引 f.弃上清，用75%己醇洗漆，4°C7500g离屯、5分钟；
[0196] g.弃上清，在室温中惊干，20 DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。
[0197] 3.反转录
[0198] a.预变性体系与预变性
[019 引 RNA 500ng-lyg
[0200] GSP(基因特异引物）（0. 5yg/反应）lyl
[0201] 无核酸酶的水 加至lOyl
[020引 70°C5分钟，完成后马上置于冰上。
[0203] b.反转录体系与反转录
[0204]
[0205] 25°C5 分钟；42°C60 分钟；70°C15 分钟；4°C<：?。
[0206] 得到cDNA产物
[0207] 4.实时巧光定量PCR
[020引按照W下体系加入
[0209]
[0210] 将W上体系溶液按每孔15ul的量加入到S个孔中。将整个反应板放于PikoReal 实时定量PCR检测系统（ThermoScientific)中。按W下程序进行实时巧光定量PCR
[0211]
[0212] 其中，变性与退火/延伸该两步共进行40个循环。
[0213] 对PCR数据进行分析。
[0214]实验结果表明（见图3)，在含有p53野生型的细胞系肥K293T细胞中， P53R175H-APT对于p53野生型的亲和力相比于scrambleRNA并无显著差别。7化为对照 组。
[0215] 实施例4、筛选得到的核酸适配体对P53R17甜有亲和力
[0216] 1.质粒构建
[0217] 将P53R17甜编码序列克隆入pIRES2-ZsGreenl中的EcoRI和BamHI两个酶切位 点中，使用如下引物，
[0218] 正向引物；GGGAATTCCACTGCCATGGAGGAGCCGCA
[0219] 反向引物；GGGGATCCGAGAATGTCAGTCTGAGTCAG
[0220] 构建好的质粒命名为pIRES2-ZsGreenl-p53R175H
[022。 将通过实施例1筛选到的序列如SEQIDNO. 1所示的核酸适配体（本发明的核酸 适配体，P53R175H-APT)和scramble序列克隆入pLKO. 1中Agel和EcoRI两个酶切位点中， 使用如下引物，
[0222] 正向引物；GCACCGGTGCAATGGTACGGTACTTC
[0223] 反向引物；CCTTAAGGTTTTTTCAAAGTAGCG
[0224] 构建的质粒分别被命名为pLK0-p53R175H-APT和pLKO-scramble。
[0225] 2.P53R17甜稳转细胞系的建立
[0226] 向H1299细胞（p53部分缺失细胞株）转染构建好的pIRES2-ZsGreenl-p53R175H 质粒。用G418 (400yg/ml)对其进行筛选。具有绿色巧光的细胞（群落）被挑选出来在24 孔板里单独培养。随后进行扩大培养。筛选后得到的稳转细胞系命名为H1299-P53R175H。
[0227] 3.MTT细胞增殖检测实验（图4a)
[022引本方法所用MIT试剂盒为凯基MIT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Cat.No.KGA312)，具体过程如下；
[0229] a.在 96 孔板加入H1299-P53R17 甜细胞lOOuL/孔（约lXl〇4)，置 37°C5%C〇2 细胞培养箱培养24小时；
[0230]b.将pLK0-p53R175H-APT和pLKO-scramble质粒分别转染进小孔里，在 37°C，含 5%C02空气及100%湿度的细胞培养箱中解育4她；
[023UC.将 5XMTT用DilutionBuffer稀释成 1XMTT。每孔加 50yL1XMTT，在 37°C解育4小时，使MIT还原为甲月赞；
[023引d.吸出上清液，每孔加150化DMS0使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀；
[0233] e.酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度。