核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术与临床医学技术领域，具体设及核酸适配体在识别并结合整 合素a4中的应用。
【背景技术】
[0002] 核酸适配体（aptamer)是一类能与祀标物质的特异性相互作用的单链DNA、RNA、 肤核酸或化学修饰的核酸序列，通常由15-80个核巧酸组成。核酸适配体可W形成特定的 S维结构与祀标分子高亲和力结合，如发卡、假结、G-四链体等结构，高特异性地结合作用 是通过范德华力、氨键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用实现的。其具有亲和力高、 特异性好、无免疫原性、易合成、改造与修饰、生物化学稳定性好、能可逆变性与复性等特 性，所W被称之为"化学抗体"。
[0003]核酸适配体可被应用在一些疾病的诊断和检测、药物祀点定位、新药研发和运输 相关药物分子等领域，目前，用于治疗癌症、艾滋病等疾病的核酸适配体也不断涌现。例如， 由Eyetch/Pfizer开发的祀向VEGF的核酸适配体（商品名Macugen) 2004年已获得抑A的 批准，成功地用于治疗年龄相关的黄斑变性。近年提出的利用细胞-SELEX技术筛选特异性 核酸适配体，进而发现肿瘤标志物的方法具有好的应用前景。但目前只有极少数成功的例 子，其中的瓶颈问题就在于位于细胞膜上的核酸适配体祀分子的纯化/鉴定。
[0004] 整合素a4又称CD49d，与整合素0 1亚单位（CD29)组成a4 0 1整合素。主要表 达于胸腺细胞、单核细胞、淋己细胞等，配体是VCAM-1和纤连蛋白，能为T细胞活化和增殖 提供协同刺激信号，参与淋己细胞间黏附W及白细胞向炎症部位迁移，同时其也表达于一 些实体瘤表面。研究表明；血栓的形成、白细胞的转移、血管发生和肿瘤细胞的转移都与整 合蛋白的激活有关，其中，CD49d的异常表达与某些血液疾病的发病及预后有关，如CD49d 与慢性淋己细胞性白血病（化roniclymphoidleukemia,化L)预后关系密，所WCD49d被 作为基于流式细胞仪分析慢性淋己细胞白血病的生物标志物。
[0005] 多发性硬化症（M巧是一种常见的慢性、炎症性、脱髓銷的中枢神经系统疾病，损 害中枢神经系统的髓銷质，从而造成神经功能缺损，该种损伤往往会导致严重残疾。每 100000人中有2-150人发病，全世界有超过一百万人受到该种疾病的困扰，种族和地理绅 度的不同其发病率也不同。那他珠单抗（化talizumab)是ELAN公司研究开发的人源化单 抗，作用祀点整合素a4, 2004年被美国抑A批准，2006年被欧盟EMA批准，目前已经在加拿 大、瑞±、澳大利亚等65个W上国家被批准上市，商品名Tys油ri，主要用于多发性硬化症 的治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供核酸适配体或其衍生物的新用途。
[0007] 本发明提供了核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合整合素a4 中的应用；
[0008] 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合整合素a4的产 品中的应用；
[0009] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
[0010] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合活性整 合素a4中的应用；
[0011] 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合活性整合素a4 的产品中的应用；
[0012] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
[0013] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测与抗整合素a4的抗 体结合的物质中的应用；
[0014] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测与抗整合素a4的抗体结合的 物质的产品中的应用；
[0015] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
[0016] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品是否含有整 合素a4中的应用；
[0017] 或核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品中整合素a4的含量中的 应用；
[0018] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品是否含有整合素a4 的产品中的应用；
[0019] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品中整合素a4的含量 的产品中的应用；
[0020] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
[0021] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在制备诊断和/或治疗多发性硬化症的 产品中的应用；
[0022] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
[0023] 上述应用中，所述衍生物为如下（1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：
[0024] (1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核巧酸，得到与所述核酸 适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[00巧](2)将序列1所示的核酸适配体进行核巧酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体 具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0026] (3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磯酸脂骨架，得到与所述核酸 适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0027](4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同 功能的核酸适配体衍生物；
[0028] (5)由序列1所示的核酸适配体编码的肤核酸，得到与所述核酸适配体具有相同 功能的核酸适配体的衍生物；
[0029] (6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/ 或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0030] 所述化）中的功能基团为生物素基团或巧光基团。
[0031] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5'端或3'端标记 巧光基团或生物素基团。
[0032] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5'端标记巧光基团 或生物素基团。
[0033] 上述应用中，所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人 胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞化la、人肝癌细胞化h-7、人膀 脱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵 巢癌细胞SK0V-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人 类T细胞白血病细胞化rkatE6-1、人回盲肠腺癌细胞肥T-8、人胚胎肾细胞肥K-293、人前 列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋己瘤化t-78或人结肠癌细胞LoVo。
[0034] 本发明的另一个目的是提供一种产品。
[0035] 本发明提供的产品的活性成分为序列1所示的核酸适配体或其衍生物；所述产品 的用途为如下1)-6)中的至少一种：
[0036] 1)识别并结合或辅助识别并结合整合素a4;
[0037] 2)识别并结合或辅助识别并结合活性整合素a4;
[0038] 3)检测或辅助检测待测样品的整合素a4的含量；
[0039] 4)检测或辅助检测待测样品中是否含有整合素a4;
[0040] 5)检测或辅助检测与抗整合素a4的抗体结合的物质；
[0041] 6)诊断和/或治疗多发性硬化症。
[0042] 上述产品中，所述衍生物为如下（1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：
[0043](1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核巧酸，得到与所述核酸 适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0044] (2)将序列1所示的核酸适配体进行核巧酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体 具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0045] (3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磯酸脂骨架，得到与所述核酸 适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0046] (4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同 功能的核酸适配体衍生物；
[0047] (5)由序列1所示的核酸适配体编码的肤核酸，得到与所述核酸适配体具有相同 功能的核酸适配体的衍生物；
[0048] (6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/ 或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
[0049] 所述化）中的功能基团为生物素基团或巧光基团。
[0050] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5'端或3'端标记 巧光基团或生物素基团。
[0051] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5'端标记巧光基团 或生物素基团。
[0052] 上述产品中，所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人 胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞化la、人肝癌细胞化h-7、人膀 脱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵 巢癌细胞SK0V-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人 类T细胞白血病细胞化rkatE6-1、人回盲肠腺癌细胞肥T-8、人胚胎肾细胞肥K-293、人前 列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋己瘤化t-78或人结肠癌细胞LoVo。
[0053] 本发明首次发现核酸适配体Sgc-4e可W特异性识别并结合整合素a4,并利用核 酸适配体Sgc-4e与整合素a4的特异性结合作用建立了检测整合素a4的方法。通过实验 证明；本发明的核酸适配体Sgc-4e具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点， 基于核酸适配体Sgc-4e建立的检测整合素a4的方法可为治疗多发性硬化症提供了新的 策略。
【附图说明】
[0054] 图1为Sgc-4e-Bio提取的整合素a4蛋白代表性的多肤的ESI-MS和MS/MS图谱。 图1A为重型同位素标记的[M+2田"离子ESI-MS谱图；图1B为轻型同位素标记的[M+2田" 离子ESI-MS谱图；图1C为重型同位素标记的[M+2田"离子MS/MS谱图，其中，R*表示重型 同位素标记的精氨酸；图1D为轻型同位素标记的[M+2田"离子MS/MS谱图。
[00巧]图2为用Sgc-4e-FAM和anti-CD49d-PE或anti-CD29-阳抗体共染色的化rkat E6-1细胞的流式细胞仪检测结果。其中，L45-FAM是巧光素标记的对照核酸序列；IgG-PE 是对照抗体。
[0056] 图3为抗整合素a4抗体或核酸适配体Sgc-4e分别与野生型K562细胞或转染后 稳定表达整合素a4的K562细胞的流式细胞仪检测结果。
[0057]图