in，室温放置15min。
[0160] 二、将上述化rkatE6-1细胞分别按照如下五组进行处理：
[016。 第一组；在含有L45-FAM(l(K)nM)的lOOuL结合缓冲液中解育化rkatE6-1细胞；
[0162] 第二组；在无二价离子、含有Sgc-4e-FAM (lOOnM)的100yL缓冲溶液中解育 JurkatE6-1 细胞；
[0163] 第S组：在只含有Mg2+离子、Sgc-4e-FAM (lOOnM)的100yL缓冲溶液中解育 JurkatE6-1 细胞；
[0164] 第四组：在只含有Ca"离子、Sgc-4e-FAM (lOOnM)的100yL缓冲溶液中解育 JurkatE6-1 细胞；
[0165] 第五组：在只含有Mn"离子、Sgc-4e-FAM (lOOnM)的100yL缓冲溶液中解育 JurkatE6-1 细胞；
[0166] 上述缓冲溶液由20mMH巧es(pH7. 4)和140mM化C1组成。
[0167] 2、流式细胞仪进行分析
[016引用流式细胞仪分别对上述五组处理后的细胞进行分析。上述每组实验设置=个独 立重复实验。
[0169] 结果如图4所示；在无二价离子存在时，整合素a4无活性，核酸适配体Sgc-4e不 与整合素a4结合；而在Mg"、Ca"或Mn"存在时，整合素a4具有活性，核酸适配体Sgc-4e 与整合素a4高特异性结合。
[0170] 实施例4、核酸适配体Sgc-4epuU-down细胞裂解液中的整合素a4
[017。 为了明确核酸适配体Sgc-4e在Westernblot、Co-IP等方面的应用，利用生物素 标记的核酸适配体Sgc-4epuU-down细胞裂解液中的整合素04。
[0172] 一、生物素标记的核酸适配体Sgc-4e溶液（Sgc-4e-FAM)的制备
[0173] 巧光素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5'端偶联巧光素基 团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-FAM，依据紫外吸收标定浓度为lOOnM后，95°C加热 5min，冰上放置5min，室温放置15min。
[0174] 二、蛋白提取
[017引 1、各取2X107个指数生长人白血病细胞CJurkatE6-1)，PBS洗漆后，分别与对照 核酸序列L45、对照核酸适配体Sgc-3b或核酸适配体Sgc-4e解育30min，然后加入1 %的甲 醒交联lOmin。
[0176]核酸适配体Sgc-3b的核巧酸序列；5'-CTTATTCAATTCCCGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCC AGTCTATGAATAAG-3' ；
[0177] 对照核酸序列L45的核巧酸序列；TT?順順順順順順順順順順順順順順順順順順 NNNNNNNNo
[0178] 2、用结合缓冲液洗漆2遍后，分别加入ImL的细胞裂解液震荡解育60min。
[0179] 3、700化pm离屯、，取上清分别加入20ul链霉亲和素琼脂糖微球，震荡解育60min， 然后洗漆5遍。
[0180]S、Westernblot
[0181] 1、微球分别加入IXSDS上样缓冲溶液，在95它加热变性30min，然后上样，150V电 压电泳；
[0182] 2、利用化ans-BlotTurbo转移系统（伯乐公司）在4°C将蛋白转膜至PVDF膜，然 后利用含5%牛奶的？85-1'牌8巧1*11〇.1%1巧6611)溶液在41：封闭解育6小时；
[0183] 3、然后加入抗〔0-49(1抗体（兔抗人抗体油81280，1;4000稀释，46〇3111，）4^过夜 解育；
[0184] 4、洗漆=遍后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗室温解育1小时；
[0185] 5、震荡洗漆S次，加入PierceE化WesternBlotting底物反应5min，显影。
[0186] 结果如图5所示；核酸适配体Sgc-4epuU-down的样品在150kD处有条带，表明 核酸适配体Sgc-4e可Wpull-down整合素a4,而对照核酸序列L45或对照核酸适配体 Sgc-3b却不能够pull-down整合素a4。说明核酸适配体Sgc-4e可W替代抗整合素a4 抗体用于Westernblot、C〇-IP、E；LISA中。
[0187] 抗整合素a4的抗体那他珠单抗OJatalizumab)是一种已在临床上应用的治疗多 发性硬化的抗体药物，而核酸适配体Sgc-4e可与具有活性形式的整合素a4结合，因此其 具有开发治疗多发性硬化的药物或制品的用途。
【主权项】
1. 核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合整合素a 4中的应用； 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合整合素a 4的产品中 的应用； 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。2. 核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合活性整合素a 4中的应用； 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合活性整合素a 4的产 品中的应用； 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。3. 核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测与抗整合素a 4的抗体结合的物质中的 应用； 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测与抗整合素a 4的抗体结合的物质 的产品中的应用； 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。4. 核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品是否含有整合素a 4中的应用； 或核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品中整合素a 4的含量中的应用； 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品是否含有整合素a 4的产 品中的应用； 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品中整合素a 4的含量的产 品中的应用； 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。5. 核酸适配体或其衍生物在制备诊断和/或治疗多发性硬化症的产品中的应用； 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述衍生物为如下（1)-(6)中 任一所述的核酸适配体的衍生物： (1) 将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配 体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； (2) 将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有 相同功能的核酸适配体的衍生物； (3) 将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配 体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； (4) 由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能 的核酸适配体衍生物； (5) 由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能 的核酸适配体的衍生物； (6) 将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功 能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； 所述（6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。7. 根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述待测样品为细胞；所述细 胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈 癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-I、人乳腺癌细 胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SK0V-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细 胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结 肠癌细胞LoVo。8. -种产品，其活性成分为序列1所示的核酸适配体或其衍生物；所述产品的用途为 如下1)-6)中的至少一种： 1) 识别并结合或辅助识别并结合整合素a 4 ; 2) 识别并结合或辅助识别并结合活性整合素a 4 ; 3) 检测或辅助检测待测样品的整合素a 4的含量； 4) 检测或辅助检测待测样品中是否含有整合素a 4 ; 5) 检测或辅助检测与抗整合素a 4的抗体结合的物质； 6) 诊断和/或治疗多发性硬化症。9. 根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述衍生物为如下（1)-(6)中任一所述 的核酸适配体的衍生物： (1) 将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配 体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； (2) 将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有 相同功能的核酸适配体的衍生物； (3) 将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配 体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； (4) 由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能 的核酸适配体衍生物； (5) 由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能 的核酸适配体的衍生物； (6) 将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功 能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物； 所述（6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。10. 根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述待测样品为细胞；所述细胞具体 为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细 胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-U人乳腺癌细胞 MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SK0V-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细 胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结 肠癌细胞LoVo。
【专利摘要】本发明公开了核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用。本发明首次发现核酸适配体Sgc-4e可以特异性识别并结合整合素α4，并利用核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的特异性结合作用建立了检测整合素α4的方法。通过实验证明：本发明的核酸适配体Sgc-4e具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点，基于核酸适配体Sgc-4e建立的检测整合素α4的方法可为治疗多发性硬化症提供了新的策略。
【IPC分类】A61K48/00, A61P25/00, C12N15/115, C12Q1/68, G01N33/68
【公开号】CN104988154
【申请号】CN201510354245
【发明人】上官棣华, 邴涛, 汪寅生, 刘祥军
【申请人】中国科学院化学研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月24日