饲料、造纸、印染、纺织等行业中应用。
【附图说明】
[0026] 图1是Bacillus subtilis sp. HFS06野生型和改良型菌株HFS07、HFS08在固体 培养基上不同生长速度，其中，HFS07和HFS08分别为一轮和多轮突变所得的改良菌株；
[0027] 图2是Bacillus subtilis sp.HFS06野生型和改良型菌株HFS08的β-甘露聚 糖酶基因 PCR片段，其中，M为DNA分子量标准；1为野生型酶基因片段manBl ;2诱变改良 型酶基因片段manBlm ;
[0028] 图3是重组表达质粒pET-26b (+) -manBl克隆的结构示意图；
[0029] 图4是重组表达质粒pET-26b(+)-manBlm克隆的结构示意图；
[0030] 图5是本发明是重组表达质粒pET-26b (+) -manBl和pET-26b (+) -manBlm的测序 鉴定图，其中，M为DNA分子量标准；1为重组表达质粒pET-26b(+)-manBl ;2为重组表达质 粒 pET_26b(+)-manBlm ;
[0031] 图6是本发明β -甘露聚糖酶基因大肠杆菌表达菌株上清液的降解底物活性测 定；
[0032] 图7是本发明β -甘露聚糖酶活的最适pH值测试结果；
[0033] 图8是本发明β -甘露聚糖酶在不同pH下的稳定性测试结果；
[0034] 图9是本发明β -甘露聚糖酶的最适活性温度测试结果；
[0035] 图10是本发明β -甘露聚糖酶在不同温度下的稳定性测试结果；
[0036] 图11是本发明甘露聚糖酶基因的表达和纯化图，其中，M为蛋白分子量标准； 1为表达酶的粗酶液；2为表达酶粗酶液经纯化柱吸附后的冲洗液；3经纯化的表达酶；
[0037] 图12是本发明野生型⑴和改良型⑵β-甘露聚糖酶基因表达酶的酶谱活性原 位测定结果；
[0038] 图13是野生型（下）和改良型（上）β-甘露聚糖酶基因表达酶的氨基酸变异。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0040] 本发明提供一种耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基因，其碱基序列为SEQ ID NO. 1。
[0041] 本发明还提供一种耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
[0042] 本发明以枯草杆菌Bacillus sp. HFS06野生菌（从热带土壤样品中分离）为原 始菌株，利用紫外和化学复合诱变方法筛选得到生产高酶活改良菌株HFS08。2)Bacillus sp. HFS08为基因挖掘出发菌株，利用基因工程手段将其β -甘露聚糖酶基因克隆并高效表 达到大肠杆菌中。它由l〇89bp的DNA组成，编码一个362个氨基酸组成的蛋白质。其理 论分子量为40. 8kDa。所述耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基因的表达产物β -甘露聚糖酶 在ΡΗ5-10和高温条件下显示活性。本发明通过分子生物学技术将本发明之耐超高温耐碱 甘露聚糖酶基因克隆到高效细菌表达系统中，转化大肠杆菌，从而获得相应的重组菌 株，可用于生产耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶。
[0043] 实施例1耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基因改良育种及其耐超高温耐碱β -甘露 聚糖酶的纯化和应用
[0044] 本发明还提供一种耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基因在制备耐超高温耐碱β -甘 露聚糖酶中的应用，包括以下步骤：
[0045] (1)从热带林业土壤样品中分离获得同时降解纤维素，木聚糖和甘露聚糖的枯草 杆菌Bacillus sp.菌株HFS06。经过16S rRNA基因序列测定，分子鉴定其属于Bacillus subtilis subsp.Spizizenii亚种，序列见SEQ ID Νο·3。选取菌株HFS06制成浓度约 l(T6Cfu/ml的悬液，用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS)在不同处理浓度和不同作用处理 时间下诱变（浓度〇. l，〇. 25,0. 5mol/L，作用时间5，10，15,30,60min)，然后在含有甘露聚 糖的选择培养基上生长，挑单菌落筛选降解圈大的菌株，待复选稳定后，再行紫外光复合诱 变，在固定紫外光强度下在不同照射时间下诱变，即UV在波长254nm、功率20w、照射距离 25cm固定条件下、照射累计时间分别为30s，60s，120s，240s (照射间隙轻轻旋转悬液）。处 理好的菌悬液严格避光，在红光下涂布在甘露聚糖选择培养基上，包以锡箔纸避光培养。挑 选在选择培养基上生长快降解圈大的单菌落，结合活性测定和生长实验，最后筛选到3株 降解活性高、生长快和继代稳定的诱变菌株，其中有一株菌的生长和酶活最为稳定，记为 HFS08,其生长状况和生长速度见表1和图1。
[0046] 如图1和表1所示，Bacillus subtilis sp.HFS06野生型和改良型菌株HFS08在 固体培养基上不同生长速度，后者生长速度明显增加。
[0047] 表LBacillus subtilis sp.HFS06野生型和改良型菌株HFS08在液体培养基中 不同生长速度
[0048]
【主权项】
1. 一种耐超高温耐碱e-甘露聚糖酶基因，其特征在于，其碱基序列为SEQIDNO. 1。
2. -种如权利要求1所述的耐超高温耐碱0 -甘露聚糖酶的核苷酸序列为SEQID NO. 2 〇
3. -种如权利要求1所述的耐超高温耐碱0 -甘露聚糖酶基因在制备耐超高温耐碱 0 _甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1、从热带林业土壤样品中分离获得枯草杆菌Bacillussp.菌株HFS06,进行诱导 和筛选，得到诱变菌株Bacillussp.HFS08 ; 步骤2、提取诱变改良菌株HFS08基因组DNA:将枯草杆菌Bacillussp.HFS08纯培养 单菌落接种至LB培养基中在30-38°C下培养10_13h，用试剂盒提取基因组DNA; 步骤3、0 -甘露聚糖酶重组菌株的构建：根据pET-26b(+)表达载体及0 -甘露聚糖酶 基因序列特点，构建表达载体，设计引物： Pl:5,-ATAGGATCCCCAYACTGTGTCGCCTGTAAAT~3,， P2 :5,-ATACTCGAGTTCAACGATAGGCGTTAAAGAATC-3' ； 以所得枯草杆菌BaciIIussp.HFS08基因组DNA为模板，通过PCR克隆法分别将 两个菌株的甘露聚糖酶基因克隆到细菌表达载体pET-26b(+)中；用限制性内切酶 BamHI和XhoI分别对0-甘露聚糖酶基因PCR-产物和载体pET-26b(+)进行双酶切， 然后将酶切后的产物连接获得重组质粒pET-26b(+)-manBlm，将重组质粒转化大肠杆菌 E.coliBL21(DE3)，并筛选阳性克隆，从而获得诱变的0-甘露聚糖酶表达菌株E.coli pET-26b(+)-manBlm； 步骤4、(6-甘露聚糖酶基因的表达：将诱变的(6-甘露聚糖酶表达菌株E.coli pET-26b(+) -manBlm接种至LB液体培养基中，在30-37 °C下振荡培养至0D600nm= 0. 4-0. 6,并加入异丙基-0 -D-硫代半乳糖苷0. 5-1.Ommol/L诱导|3 -甘露聚糖酶基因的 表达； 步骤5、0-甘露聚糖酶酶学活性的检测： 诱导后的重组菌上清液进行平板活性测定，在槐豆胶平板加入上述上清原液或稀释液 3微升，30°C下培养6-12h然后现在刚果红染色以确定其酶解情况；或者将诱导后的重组菌 上清液用纯水稀释10倍后，取ImL稀释液与ImL槐豆胶溶液混合，55°C反应lOmin，然后用 DNS法测定水解产生的还原糖； 步骤6、重组e-甘露聚糖酶的纯化和酶谱分析：利用硫酸铵沉淀法将分泌型表达的重 组目的蛋白进行沉淀，再经Ni-NTA柱纯化；同时制备2块Native-PAGE胶，加0. 2wt%槐豆 胶溶液于Native-PAGE的分离胶中；分别加同样的表达酶蛋白样品与2块Native-PAGE中 平行电泳，结束后一个胶做考马斯亮蓝染色，另一个加槐豆胶的PAGE用刚果红染色，以原 位检测表达酶的活性，重组甘露聚糖酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
4. 根据权利要求3所述的耐超高温耐碱0 -甘露聚糖酶基因在制备耐超高温耐碱 0-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，所述步骤1中从热带林业土壤样品中分离获得枯草 杆菌Bacillussp.菌株HFS06,进行诱导和筛选，得到诱变菌株Bacillussp.HFS08具体 为： ①原始菌株从热带林业土壤样品中分离获得，具有同时降解纤维素，木聚糖和甘露聚 糖的活性；经鉴定其为枯草杆菌Bacillussubtilissubsp.Spizizenii亚种，记为HFS06 ; ②选取菌株HFS06制成浓度约10~6Cfu/ml的悬液，用化学诱变剂甲基磺酸乙酯在不同 处理浓度和不同作用处理时间下诱变，然后在含有甘露聚糖的选择培养基上生长，挑单菌 落筛选降解圈大的菌株，待复选稳定后，再行紫外光复合诱变，在固定紫外光强度下在不同 照射时间下诱变，即UV在波长254nm、功率20w、照射距离25cm固定条件下、照射累计时间 分别为30s，60s，120s，240s，照射间隙轻轻旋转悬液；复合诱变处理的菌悬液严格避光，在 红光下涂布甘露聚糖选择培养基上，包以锡箔纸避光培养；最后筛选获得代表性菌株，其 具有降解活性高、生长快和继代稳定的特点，诱变菌株，记为Bacillussp.HFS08。
5.根据权利要求4所述的耐超高温耐碱0 -甘露聚糖酶基因在制备耐超高温耐碱 甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，所述用化学诱变剂甲基磺酸乙酯在不同处理浓度和 不同作用处理时间下诱变，具体的浓度和时间分别为：浓度〇.l，〇. 25,0. 5mol/L，作用时间 5,10,15, 30,60min〇
【专利摘要】本发明公开了一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因，其碱基序列为SEQ ID NO.1。本发明还公开了一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明还公开了一种上述耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因在制备耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶中的应用。本发明获得的表达酶可以广泛耐受碱性(pH7-10)和高温(80-100℃)环境，纯化的表达酶比活最高可达10400U/mg。本发明之β-甘露聚糖酶具有耐超高温、耐碱特性，适于在生物质降解、食品、饲料、造纸、纺织等化工行业中应用。
【IPC分类】C12N9-42, C12N13-00, C12R1-125, C12N15-70, C12N15-56, C12N15-01
【公开号】CN104726481
【申请号】CN201510089569
【发明人】胡传炯, 万霞, 龚阳敏, 江木兰, 石燕, 黄凤洪
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月27日