一种脂肪酶编码基因及其工程菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种脂肪酶编码基因及其工程菌株。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC3. I. 1. 3)即三酰基甘油水解酶，能够在油水界面发挥活性，可 催化水解、酯化、酯交换、酸解、醇解、氨解等多种反应。脂肪酶来源十分广泛，动物、植物和 微生物都可产生脂肪酶。其中微生物脂肪酶产量最高，基因操作简单，相对于动植物脂肪酶 更加稳定。而且微生物脂肪酶以其酶活力高、选择性强和底物广泛等优点在工业应用中得 到极大地推广。
[0003] 脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，且反应不需要 辅酶，反应条件温和，副产物少。因此，脂肪酶的应用十分广泛，如食品工业、医药卫生、化 学化工、环境保护、能源开发等领域，已成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的一类 酶。
[0004] 随着细胞工程、基因工程、固定化酶技术以及界面酶促反应等技术的快速发展，对 脂肪酶的研究进一步深入，特别是对产脂肪酶的菌株进行诱变育种及分子改造等方面取得 了长足进展。然而，脂肪酶在应用中需要克服几个瓶颈：酶成本高、活性低、稳定性低和低反 应产率。因此，为了进一步提高脂肪酶在工业领域中的应用，筛选和开发出具有新型催化活 性和高稳定性的微生物脂肪酶将成为脂肪酶研究的热点和重点，新型脂肪酶的深入开发研 究可以采取新的生物技术手段来实现，本试验根据毕赤酵母密码子偏好性，优化白地霉脂 肪酶的基因序列，以期获得商活性、商广量、商稳定性的脂肪酶，从而为油脂精深加工、生物 能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供一种脂肪酶编码基因。
[0006] 本发明还有一个目的在于，提供所述脂肪酶基因编码的脂肪酶。
[0007] 本发明还有一个目的在于，提供一种转化有所述脂肪酶编码基因的工程菌株。
[0008] 本发明提供的脂肪酶编码基因，所述基因序列如SEQ ID NO :1所示，具体地根据毕 赤酵母密码子偏好性，重新设计白地霉脂肪酶基因，以高使用频率的密码子替代低使用频 率密码子，保持成熟蛋白的氨基酸序列不变。
[0009] 本发明的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 本发明的工程菌株转化有所述脂肪酶编码基因，工程菌为毕赤酵母；具体地，通过 将所述脂肪酶编码基因构建重组表达质粒，然后转化毕赤酵母而获得。
[0011] 一种工程菌株，含有上述脂肪酶的质粒。
[0012] 所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)，该菌株已于2013年12月12 日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 8569。
[0013] 所述工程菌株应用于工业化生产脂肪酶中。
[0014] 本发明通过基因工程技术，利用白地霉（Geotrichum candidum)的脂肪酶基因序 列（GenBank:JX074060. 11，如SEQ ID N0:3)和毕赤酵母密码子偏好性，合成了脂肪酶编码 基因，并将其转入毕赤酵母中，从而能获得高活性、高产量、高稳定性的脂肪酶。5升发酵罐 的发酵活力达到299U/mL，该脂肪酶的最适催化温度为45°C，最适pH值为8. 2,为油脂精深 加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。
【附图说明】
[0015] 图1脂肪酶的最适pH值分析图；
[0016] 图2脂肪酶的最适催化温度分析图。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0018] 实施例1、白地霉脂肪酶基因克隆与序列分析
[0019] 白地霉（Geotrichum candidum)由本实验室保存。接种至YPD液体培养基，28°C振 荡培养过夜，12000rpm离心收集菌体。用总DNA提取试剂盒提取总DNA。根据GenBank报 道的脂肪酶酶基因序列设计引物（Lip-F :5' - CGGAATTCCAGGCCCCCACGGCCGTT-3'和Lip-R : 5' - GCTCTAGATTAACCGTAGAGATTAAGG-3'）。以白地霉总 DNA 为模板，PCR 扩增 lipase 基 因序列，扩增条件为：95°C 3min，40个循环（94°C 30s，58°C 30s，72°C lmin)，最后70°C延伸 5min。PCR产物经过序列测定后，序列用DNAMM. 0软件分析。
[0020] 实施例2、脂肪酶基因序列优化设计
[0021] 根据毕赤酵母密码子偏好性，重新设计白地霉脂肪酶基因，以高使用频率的密码 子替代低使用频率密码子，保持成熟蛋白的氨基酸序列不变。设计好的序列由北京擎科生 物技术有限公司进行全合成。为了方便克隆，在序列的5'、3'末端分别设计EcoRI和XbaI 酶切位点。
[0022] 实施例3、毕赤酵母表达载体的构建和转化
[0023] 用限制性内切EcoRI和XbaI对实施例2合成的基因进行双酶切后，将其连入经相 同酶切的载体口？102€^(1鮮;[1：1'(^611，1154)中€[因子序列的下游，将连接产物转化大肠杆 菌ToplO感受态细胞，用含有25 μ g/mL抗生素 Zeocin的LB抗性平板筛选出阳性克隆，提 取质粒，获得脂肪酶的毕赤酵母表达载体，命名为X-33 / pPIC-lip-opt。
[0024] 取IOyL毕赤酵母表达载体X-33 / pPIC-lip-opt，将其用限制性内切酶Sac I在 37°C下酶切24h。加入80 μ L毕赤酵母X-33感受态细胞，混匀，置于0. 2cm电击杯中，冰浴 5min，在2000伏电压（25yF)条件下电击，迅速加入ImL lmol/L山梨醇，置于28°C静止培 养2h。然后将培养物涂布于含抗生素 Zeocin (100 μ g/mL)的YPDS (1 %酵母提取物，2% 蛋白胨，2 %葡萄糖，2%琼脂，其余为水）平板上，在28°C下培养3-4d，直至长出清晰的菌 落。
[0025] 实施例4、高效分泌表达脂肪酶毕赤酵母工程菌株的筛选
[0026] 挑取阳性重组子，将其接种于含30mL BMGY (1%酵母提取物，2%蛋白胨，1. 34% YNB，4X 10-5% biotin，1 %甘油，IOOmM pH6. 0磷酸盐缓冲液，其余为水)培养基的250mL摇 瓶中，于28°C、250-300rpm培养至0D600为2-6,然后室温下离心收集菌体，用BMMY (1%酵 母提取物，2%蛋白胨，0. lmol/L磷酸缓冲液pH6. 0, I. 34%YNB，4X 10-5%生物素）重悬菌体， 使0D600为1.0,再用终浓度为0.5% (V/V)的甲醇为唯一碳源进行诱导培养。结果筛到1 株酶活较高的重组菌，命名为X-33 / pPIC-lip-opt。
[0027] 橄榄油乳化液底物5ml和Tris-HC14ml缓冲液溶液混合于40°C预热5min，然后再 吸取适当稀释的酶液和煮沸的酶液各Iml加入底物中充分混合，于40°C恒温水浴IOmin加 入15ml无水乙醇溶液，振荡混匀，终止酶反应。于空白和样品溶液中各加酚酞指示剂两 滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化 钠标准溶液的体积。酶活定义：在一定温度和pH条件下，每分钟内底物降解释放1 μ mol的 可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位（U)。
[0028] 实施例5、脂肪酶酶毕赤酵母工程菌株在5L发酵罐中的发酵
[0029] 挑取实施例4获得的重组毕赤酵母菌株X-33 / pPIC-lip-opt，将其接种于装有 200mL BMGY培养基的3L摇瓶中，在28-30°C、250rpm下振摇12-24h，得到0D600约为3. 0的 种子液。然后配制2L BMGY培养基，装入5L自动控制发酵罐中，在121°C下灭菌后，冷却至 28. 5°C，加入上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5. 0,通过调节转速和空气流量控制溶氧 大于30%。经测定，接入种子液30h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100% )，进入流加50% (W/V)甘油阶段，流速为60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100%)，进入甲醇 流加阶段，流速为12mL/h，同时控制溶氧为20 %以上(如不能使溶氧保持在20 %以上，停止 添加甲醇，直至溶氧回升)。3h后，将甲醇流速调到24mL/h，再过2h，将流速调到30mL/h， 并保持到发酵最后，同时，分别于诱导表达96h后收集发酵液，测酶活。酶活分析结果表明， 诱导到第108h发酵活力达到299U/mL。
[0030] 实施例6 :本试验说明脂肪酶酶学性质分析程序
[0031] (1)最适 pH 值
[0032] 最适 pH值的确定：分别用 pH值为 2· 2、3· 2、4· 2、5· 2、6· 2、7· 2、8· 2、9· 2、10· 2 的磷 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液及Tris-HCl配制底物，于40°C反应温度下测定酶活力，确定该酶 的最适pH值(参见图1)。
[0033] (2)最适温度
[0034] 最适温度的确定：用40mM Tris-HCl缓冲液配制橄榄油乳化液底物，分别在 30-60°C测定酶活力，确定其最适反应温度(参见图2)。
【主权项】
1. 一种脂肪酶编码基因，其特征在于，所述基因序列如SEQIDNO:1所示。
2. 根据权利要求1所述的基因编码的脂肪酶。
3. -种工程菌株，其特征在于，所述菌株含有表达如权利要求2所述脂肪酶的质粒。
4. 根据权利要求3所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母，保藏编 号为CGMCCNO. 8569,保藏日期为2013年12月12日。
5. 根据权利要求3或4所述的工程菌株在工业化生产脂肪酶中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种脂肪酶编码基因及其工程菌株，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述菌株含有表达所述脂肪酶的质粒，所述菌株为巴斯德毕赤酵母（CGMCC NO.8569），该菌株表达得到的脂肪酶，在5升发酵罐的发酵活力达到299U/mL，最适催化温度为45℃，最适pH值为8.2，该脂肪酶为油脂精深加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。CGMCC No856920131212
【IPC分类】C12R1-645, C12N15-55, C12R1-84, C12N1-19, C12N9-20
【公开号】CN104726477
【申请号】CN201310718510
【发明人】曹云鹤, 董冰, 陆文清, 郭晓晶, 谢飞, 杨雯涵
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月23日