水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因育种技术领域，具体涉及水稻低磷胁迫转录因子〇sPHR2在小 麦中的应用。
【背景技术】
[0002] 磷素是植物生长和发育所必需的大量元素之一，是核酸、磷脂和ATP等生命大分 子的重要组成成分，在植物的全生育期内起着极其重要的作用，全国土壤普查结果表明，我 国有近半数省（区）其总面积的50%以上的土壤有效磷含量在5mg/kg以下，土壤有效磷含 量在10mg/kg以下的占到80% -90%，土壤缺磷是作物生产的主要限制因素之一。当环境 中磷匮乏时，植物形态发育上的变化主要是根构型的变化，包括增加根茎比，侧根数目以及 根毛的数目和长度等。度等（陈Il等，2011 ;Abel et al，2011 ;Lopez_Bucio et al，2002 ; Ma et al，2001)。生理生化方面的变化包括高亲和Pi转运体的诱导表达，土壤分泌有机 酸，内源磷酸酶和RNase的诱导表达，以及增加有机酸和质子的释放，从而来增加磷的吸收 和再循环能力。
[0003] MYB转录因子中的MYB-CC家族基因成员是参与植物对营养成分饥饿胁迫调控过 程的重要基因。Wykoff等通过图位克隆的方法首先从拟南芥中克隆了 AtPHRl基因，并证明 该基因属于MYB-CC家族成员，参与了磷酸盐饥饿应答信号传导途径。浙江大学吴平教授课 题组从水稻中克隆了 2个拟南芥AtPHRl的同源基因 OsPHRl和0sPHR2,系统进化树分析表 明，OsPHRl和0sPHR2与AtPHRl同属于MYB-CC家族成员，两个基因都通过调节磷饥饿诱导 基因的表达而参与磷饥饿信号传导，具有相似的功能。但只有0sPHR2的超表达株系能够在 正常磷的环境下使水稻大量富集磷，且一些磷转运蛋白也相应的上调。在低磷条件下，过量 表达0sPHR2基因可提高植物根系对低磷信号的响应，植株根构型的改变较野生型株系更 为强烈，其结果是根增长，根毛增多，磷吸收利用率显著提高。0sPHR2是水稻磷信号调控体 系的重要因子，在土壤缺磷条件下可显著提高植物对磷的吸收。
[0004] 本发明将0sPHR2基因导入到普通小麦品种郑麦0856中，创制出了可稳定表达与 遗传，无选择标记，且磷素吸收利用效率较受体郑麦0856明显提高的转基因小麦材料，为 选育节本高效优质转基因小麦品种提供技术和材料支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2在小麦中的应用，通过构建 了水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2的线性表达载体，利用基因枪介导法将其导入到普通小 麦品种郑麦0856中，仓ij制出了可稳定表达与遗传，磷素吸收利用效率较受体郑麦0856明显 提尚的转基因小麦材料，为选育尚广优质资源尚效利用转基因小麦新品种提供技术和材料 支撑。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] 本发明提供了水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2在小麦中的应用，通过将水稻低磷 胁迫转录因子0sPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗 传与表达的转基因小麦植株。其具体通过以下步骤完成：
[0008] I) 0SPHR2基因线性表达载体的构建；
[0009] 2)将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织；
[0010] 3)抗性再生植株的PCR鉴定。
[0011] 进一步
[0012] 步骤⑴具体为利用HindIII酶切含有0sPHR2基因的环状表达载体 pWMB003-0sPHR2,获得含有目的基因的线性载体，该片段长3kb，是只含有玉米Ubiquitin 启动子、0sPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。
[0013] 步骤（2)具体为以郑麦0856的幼胚为受体材料，在MS诱导培养基暗培养4-5d后， 置于高渗培养基渗透处理4-6h，将含有目的基因线性载体和含有bar基因线性载体，利用 基因枪介导法共转化小麦愈伤组织，在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基， 培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基，连续筛选2代，筛选的抗性苗转至生根培养 基，生根、壮苗后移栽，获得抗性再生植株。
[0014] 步骤（3)具体为提取再生植株的基因组DNA，根据0sPHR2基因序列设计了一对特 异性引物 PHR2P1 :5' -AATATGGAGGCTTTGAACC-3' 和 PHR2P2 :5' -TAACACACCCTTGGGAGTA-3'， 扩增程序为：95°C 2分钟；95°C 20秒，58°C 30秒，72°C 30秒，38个循环；72°C 10分钟，目 的片段长度为476bp ;PCR反应体系为：10-50ng/ul基因组模板；10 μΜ的PCl和PC2各 0·5μ1;2·5μ1 IOXReaction Bu ??θ；τ;4μ1 dNTP mix(2.5mM) ;0·5μ1 Taq 酶，加水至 25 μ 1〇
[0015] 所述的MS诱导培养基为：MS+2mg/L 2, 4-D+O. 4%琼脂+3%蔗糖，ρΗ6· 2 ;
[0016] 所述的高渗培养基为：MS+2mg/L 2, 4-D+0. 7%琼脂+甘露醇+3%蔗糖，ρΗ5· 8 ;
[0017] 所述的草丁膦抗性筛选再生培养基为：l/2MS+0. 5mg/L ΝΑΑ+2. Omg/L ΚΤ+0. 4%琼 脂+3%蔗糖+4%??1'，？册.2;
[0018] 所述的生根培养基为：l/2MS+0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 4%琼脂+3%蔗糖，pH6. 5。
[0019] 本发明还提供了一种含有目的基因0sPHR2的线性表达载体，该片段长3kb，是只 含有玉米Ubiquitin启动子、0sPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。
[0020] 本发明的有益效果为：长期以来，国内外将小麦近缘种属和其它物种的磷高效基 因导入普通小麦的主要技术途径为通过远缘杂交方法，但一直未获得突破性进展。其主要 原因为近缘种属和其它物种与小麦之间存在着生殖隔离。本发明技术方案可以打破物种之 间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良 瓶颈问题的主要技术途径。、
【附图说明】
[0021] 图1是植物表达载体pWMB003-0sPHR2结构示意图；
[0022] 图2是转0sPHR2基因小麦植株基因组DNA扩增电泳图；I :0sT5-l ;2,3,4,5 :阴性 植株；6 :0sT5-7 ;7 :0sT5-28 ;8 :0sT5-167 ;9 :0sT5-183 ;10 :受体郑麦 0856 ;11 :阳性对照； M：Marker ；
[0023] 图3是转基因小麦株系目的基因0sPHR2的Southern杂交分析；M :1Kb DNALadder ;+ :阳性对照（质粒）；1，2, 3 :受体郑麦0856 ;4, 5, 6 :转基因株系OsT5-28 ; 1，4一BamHI 酶切；2, 5-KpnI 酶切；3, 6- SacI 酶切；
[0024] 图4是转基因小麦0sPHR2基因的RT-PCR检测；，2, 3 :转基因株系0sT5-28 ;CK :未 转化对照（郑麦0856) ;A为0sPHR2基因的扩增产物，B为actin基因的扩增产物；
[0025] 图5是转基因小麦株系0sT5-28旗叶Western杂交结果；1 :转基因株系0sT5-28 ; 2 :阳性对照水稻；WT :未转化对照（郑麦0856);
[0026] 图6是不同条件下转基因小麦株系和对照的最长根长比较；
[0027] 图7是不同条件下转基因小麦株系和对照的根鲜重比较。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0029] 实施例1
[0030] 实验用质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自百泰克公司，Prime Star TaqDNA聚合酶、大肠杆菌（Escherichia coli)菌株DH5a感受态细胞制备试剂盒均 为TaKaRa公司产品，限制性内切酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品，其 余试剂为进口或国产分析纯。
[0031] l)0sPHR2基因线性表达载体的构建