:对蛋白样品用BCA试剂盒进行蛋白定量；
[0081] B :根据SDS-PAGE上样量需要，用水及5Xloading buffer调整蛋白浓度，100°C煮 沸变性5min。
[0082] 2) SDS-PAGE
[0083] A :根据目的蛋白的分子量，配制8%分离胶凝胶，浓缩胶浓度为5% ;
[0084] B :待检测蛋白样品上样量：上样30 μ g ;
[0085] C :电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min ;分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝到凝胶 底部。
[0086] 3)转膜
[0087] A :转膜方法：半干法；
[0088] B :转膜条件：采用半干法时，按照电流I. 2mA/cm2膜面积，恒流转膜；0. 45 μ m孔 径NC膜，转膜时间Ih ;
[0089] C :转膜后用丽春红染色试剂（Cat# :CW0057)对膜染色，观察转膜效果。
[0090] 4) Western blot 检测目的蛋白
[0091] A :封闭：将膜浸没在5%脱脂奶粉（TBST溶解的，pH7. 5)中室温轻摇Ih(封闭液 须覆盖整张膜，且膜在其中能够摇动为宜）；
[0092] B :-抗孵育：用封闭液稀释一抗，室温孵育30min，放4°C过夜；
[0093] C:洗膜：TBST洗膜3次，每次IOmin ;
[0094] D :二抗孵育：用Western blot封闭液II稀释二抗，羊抗兔-HRPl: 5000,室温轻摇 40min ；
[0095] E :洗膜：TBST洗膜3次，每次3min ;
[0096] F :ECL 反应、胶片曝光：一张 8cmX 6cm 大小的膜用 Iml ECL (500 μ IA 液 +500 μ IB 液）反应3min，曝光Imin (曝光时间随不同光强度而调整），显影2min，定影；
[0097] G :洗膜：TBST洗膜3次；
[0098] H :封闭：将膜浸没在Western blot封闭液中室温轻摇30min ;
[0099] I :孵育内参：加 Beta-actin鼠单抗，用Western blot封闭液稀释抗体，I :3000稀 释，12ml体系，室温孵育30min后放于4°C过夜；
[0100] J :洗膜：TBST洗膜5次，每次3min ;
[0101] K :二抗孵育：用Western blot封闭液稀释二抗，羊抗小鼠-HRPl: 5000,室温轻摇 40min ；
[0102] L :洗膜：TBST洗膜5次，每次3min ;
[0103] M :ECL 反应、胶片曝光：一张 8cmX 6cm 大小的膜用 Iml ECL (500 μ I A 液 +500 μ 1 B液）反应3min，曝光IOs (曝光时间随不同光强度而调整），显影，定影。
[0104] 转基因小麦旗叶Western杂交分析结果（图5)显示0sT5_28株系出现了阳性条 带，而非转基因小麦未出现阳性条带，表明目的基因0sPHR2在小麦转基因植株中得到了稳 定正确表达。
[0105] 实施例6转基因小麦磷素吸收利用特性分析
[0106] 1)根系特性分析
[0107] 通过水培实验，设置全磷（磷浓度为0. 2mmol/L)、低磷（0. lmmol/L)和缺磷 (Ommol/L)三个处理，每个处理3次重复，在营养液中培养20天后取样，利用根系扫描仪测 定转基因小麦和对照的根长（L)。从图6和图7中可以看出，转基因小麦的最长根长在低 磷和缺磷条件下均明显高于对照，全磷条件下与对照差异不明显。转基因小麦的根鲜重在 低磷和缺磷条件下略高于对照。表明0sPHR2基因可以改善小麦的根部特征，从而提高转 0sPHR2基因小麦的磷素吸收利用效率。
[0108] 2)农艺特性调查分析
[0109] 郑麦0856与其转基因系相比，田间长势无明显差异，表现为：半冬性中熟品种， 幼苗半匍匐，苗期叶片稍窄，叶色浅绿，长势壮，冬季抗寒性好；成株期株型松紧适中，旗叶 偏大上举，穗下节短，株行间通风透光性好；平均株高75. 4cm，茎杆粗壮，弹性较好，较抗倒 伏；纺锤型大穗，长芒，穗层整齐；籽粒角质，大小均匀，黑胚少，饱满度好，籽粒外观商品性 较好；产量试验结果表明（表1):郑麦0856转0sPHR2基因小麦新品系0sT5-28、0sT5-167、 0sT5-306较野生型对照增产显著，分析其产量构成因素发现，穗粒数和千粒重的提高是其 增产的主要因素。
[0110] 表1:转基因小麦新品系与对照产量试验结果
[0111]
[0112]
【主权项】
1. 水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2在小麦中的应用，其特征在于：通过将水稻低磷胁迫 转录因子0sPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与 表达的转基因小麦植株。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于包括以下步骤： 1)OsPHR2基因线性表达载体的构建； 2) 将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织； 3) 抗性再生植株的PCR鉴定。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（1)具体为利用HindIII酶切含有 OsPHR2基因的环状表达载体pWMB003-0sPHR2,获得含有目的基因的线性载体，该片段长 3kb，是只含有玉米Ubiquitin启动子、OsPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2)具体为以郑麦0856的幼胚为受 体材料，在MS诱导培养基暗培养4-5d后，置于高渗培养基渗透处理4-6h，将含有目的基因 线性载体和含有bar基因线性载体，利用基因枪介导法共转化小麦愈伤组织，在高渗培养 基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基，培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基，连 续筛选2代，筛选的抗性苗转至生根培养基，生根、壮苗后移栽，获得抗性再生植株。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于： 所述的MS诱导培养基为：MS+2mg/L2, 4-D+0. 4%琼脂+3%蔗糖，pH6. 2 ; 所述的高渗培养基为以5+211^/12,4-0+0.7%琼脂+甘露醇+3%蔗糖，？册.8; 所述的草丁膦抗性筛选再生培养基为：l/2MS+0. 5mg/LNAA+2.Omg/LKT+0. 4%琼脂 +3%蔗糖+4%?卩!'，？册.2; 所述的生根培养基为：l/2MS+0. 2mg/LNAA+0. 4%琼脂+3%蔗糖，pH6. 5。
6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（3)具体为提取再生植株的基因组 DNA，根据OsPHR2基因序列设计了一对特异性引物PHR2P1 :5' -AATATGGAGGCTTTGAACC-3'和 PHR2P2 :5' -TAACACACCCTTGGGAGTA-3'，扩增程序为：95°C2 分钟；95°C20 秒，58°C30 秒， 72°C30秒，38个循环；72°C10分钟，目的片段长度为476bp;PCR反应体系为：10-50ng/ul 基因组模板；IOuM的PCl和PC2各0.5yl;2.5ylIOXReactionBuffer;4yldNTPmi x(2. 5mM) ;0? 5yITaq酶，加水至 25yI。
7. -种含有目的基因0sPHR2的线性表达载体，其特征在于：该片段长3kb，是只含有玉 米Ubiquitin启动子、0sPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。
【专利摘要】本发明提供了水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用，通过将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株。其具体通过以下步骤完成：OsPHR2基因线性表达载体的构建；将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织；抗性再生植株的PCR鉴定。利用基因枪介导法将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2的线性表达载体导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株，为选育高产优质资源高效利用转基因小麦新品种提供技术和材料支撑。
【IPC分类】C12N15-82, A01H5-00
【公开号】CN104726484
【申请号】CN201510057355
【发明人】许为钢, 毛传澡, 李艳, 齐学礼, 王会伟, 董海滨, 吴忠长
【申请人】河南省农业科学院小麦研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月4日