[0063] 为了检测1)中的PCR阳性株中8981基因是否得到转录，进一步进行RT-PCR检测。
[0064] a.从1)鉴定为阳性的旱稻中随机挑选6个，以叶片为材料采用TRIZOL法各自提 取总RNA，取2 μ g总RNA，采用MMLV (promega)制备cDNA，整个操作均按照试剂盒推荐的条 件进行。以获得的非转化旱稻和转基因旱稻植株的cDNA为模板，进行半定量PCR扩增。
[0065] b.根据已报道的水稻ACTIN基因序列设计内参引物，正向引物ACTIN-S^ -TCCA TCTTGGCATCTCTCAG-3 '，反向引物 ACTIN-A: 5 ' -GTACCCGCATCAGGCATCTG-3 '，PCR 反应程 序为：96°C预变性3min ;94°C变性40s ;55°C退火40s ;72°C延伸30s ;25个循环；72°C延伸 IOmin0
[0066] c.将PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳得到450bp的片段即为水稻ACTIN的 片段。调节cDNA模板浓度，使非转化旱稻和转8981旱稻植株扩增片段亮度一致。
[0067] d.根据步骤c确定的非转化旱稻和转8981基因旱稻植株cDNA模板浓度，进行 8981 基因的 PCR 扩增。正向引物 BDL-S: 5 ' -AAT TTCTTTCTTTTTGGATTA-3 '，反向引物 BDL-A:5 ' -TGCGGTGTCT TATTTACTAT-3 '，PCR 反应程序为：96°C预变性 3min ;94°C变性 40s ;58°C退火 40s ;72°C延伸 50s ;25 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0068] 将PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳结果如图3所示，电泳得到0. 8kb的产 物即为8981基因片段，图中M为Marker，从下到上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2000bp，最亮条带为750bp ;1-6为在步骤1)中随机挑选的6个鉴定为阳性的转基 因旱稻植株RT-PCR结果。可以看出不同的植株转入的外源基因在RNA水平上都有表达，但 是不同的植株表达峰度是不同的。
[0069] 试验例3抗逆、抗除草剂功能检测
[0070] 为了鉴定转基因植株的特性，开展了转基因植株的干旱、盐碱以及除草剂的胁迫 试验。
[0071] 1、转基因旱稻抗旱鉴定
[0072] 将100个1~3代转基因旱稻株系的颗粒饱满的种子（每株系30粒）和野生型种子 分别使用5%次氯酸钠消毒5min，清水冲洗3次，铺于放置滤纸的培养皿中，3-4天露白后小 心转移至底部剪开的96孔板上。96孔板放置于普通塑料方盘中，板距离方盒底部10cm，人 工气候箱中培养，光照强度为801ux，温度25°C，每天光照16h。使用hogland培养液进行培 养（ph6. 5)，进入三叶期后使用15 % PEG4000处理，结果如图4所示，非转基因植株在PEG 胁迫下迅速萎蔫干枯，而转基因株系相对生长良好，有部分植株仍生长旺盛。复水后，野生 型植株完全枯死，而转基因株系的部分在胁迫中变黄萎蔫的植株恢复活力。此结果表明抗 旱基因已成功转化并在旱稻中稳定高效表达。
[0073] 2、转基因旱稻抗盐鉴定
[0074] 将PCR鉴定后阳性植株的种子和野生型种子消毒处理后放在NaCl溶液中萌发。实 验结果表明转基因植株抗盐能力高于野生型植株，在0. 75% NaCl胁迫处理时萌发差别较 为明显（图5)。处理5天后，转基因旱稻芽与根的长度都优于非转基因旱稻。
[0075] 3、转基因旱稻抗除草剂鉴定
[0076] 如前所述方法在96孔板上培养转基因旱稻和非转基因对照材料。幼苗长至三叶 一心期时，喷洒浓度为0. 8mg/ml的除草剂basta，处理3d后进行观察，如图6所示，非转基 因对照已基本死亡而转基因植株则继续生长，只是植株整体发黄且叶尖部分萎蔫。由此可 见，除草剂浓度为〇.8mg/ml时能有效区分转化苗与非转化苗。实验结果表明本实验室培 育的转基因旱稻对除草剂有明显抗性，外源质粒成功转化并表达。
[0077] 为了检测转基因旱稻的田间抗除草剂能力，将100个转基因株系的T3代播种于大 田，45天时以500mg/L浓度喷洒草铵膦，15天后观察发现，非转基因对照全部枯萎死亡，而 所有的转基因株系生长良好（图7)，表明外源基因成功转化并使得转基因旱稻具有良好的 对除草剂的抗性。
[0078]
[0079」
【主权项】
1. 一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 利用抗逆8981基因构建重组表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981 ; 2) 将重组表达载体转化入农杆菌，并利用农杆菌菌液侵染目的旱稻的胚性愈伤组织， 利用共培养基培养； 3) 对共培养后的愈伤组织脱菌并恢复，转移至含有草铵膦的筛选培养基中进行筛选； 4) 将筛选的抗性愈伤组织经预分化和分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养 基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗逆、抗除草剂的转基因旱稻。
2. 根据权利要求1所述的一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在于： 所述的8981基因序列为SEQIDNO. 1。
3. 根据权利要求1所述的一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在 于：所述的重组表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981的构建方法为：用EcoRI和BamHI酶切 Ubi-T载体，得到含有Ubiquitin基因的片段；用BamHI和PmlI酶切8981-T载体，得到含 有8981基因的片段；将含有Ubiquitin和8981基因的片段依次插入到载体pCAMBIA3301 的多克隆位点中，得到所述重组表达载体。
4. 根据权利要求3所述的一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在于： 所述的Ubi-T载体为：通过将Ubiquitin基因连接pGEM-T vector得到，所述的 Ubiquitinp基因PCR扩增引物如SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 3 所示； 所述的所述8981-T载体为：将8981基因连接pGEM-Tvector得到，所述的8981基因PCR扩增引物如SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示。
5. 根据权利要求1所述的一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在于： 所述目的旱稻为鲲旱1号。
6. 根据权利要求1所述的一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其特征在于： 所述的共培养基为：NB+2, 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+葡萄糖10g/L+AS20mg/L+凝胶3. 2g/ L，培养条件为：pH5. 2,25°C暗培养3天； 所述的愈伤组织恢复培养基为：NB+特美汀500mg/L+麦芽糖30g/L+凝胶0. 58 %，pH6. 0,培养条件为：28°C暗培养7天； 所述的筛选培养基为：NB+麦芽糖30g/L+特美汀300mg/L+草铵膦40mg/L+凝胶3. 2g/L，pH6. 0,28°C避光筛选三轮； 所述的预分化培养基为：NB+NAAlmg/L+6-BA3mg/L+ABA3mg/L+麦芽糖30mg/L+特美汀 300mg/L+ 草按膦 40mg/L+ 凝胶 3. 2g/L，pH6. 0 ; 所述的分化培养基为：NB+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+麦芽糖30g/L+植物凝胶3. 2g/L，pH5. 8 ； 所述的生根培养基为：1/2MS+蔗糖30g/L+NAA0. 5mg/L+植物凝胶I. 6g/L，pH5. 8。
【专利摘要】本发明公开了一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，其利用抗逆8981基因构建重组表达载体，转化入农杆菌，使用农杆菌菌液侵染目的旱稻的胚性愈伤组织并培养，再经筛选培养基进行筛选，将筛选的抗性愈伤组织经预分化和分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到的旱稻经PCR和RT-PCR检测鉴定为转基因阳性旱稻。经T3代植株生理试验证实该旱稻具有对干旱、盐碱以及草铵膦的抗性。本发明方法可得到对逆境及除草剂草铵膦具有良好抗性的转基因旱稻株系，在培育新的抗逆旱稻品种中有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15-29, A01H4-00, A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104726488
【申请号】CN201510140056
【发明人】魏景芳, 李朝炜, 朱昀, 韩春雨, 李冬杰, 刘颖
【申请人】河北科技大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月29日