专利名称：：肝素结合蛋白的重组生产的制作方法肝素结合蛋白的重组生产相关申请本申请要求下述申请的优先权及利益2005年12月22日提交的美国临时申请流水号60/753,615和2006年7月14日提交的美国临时申请流水号60/807,432，在此完整收录其说明书。发明领域本发明涉及用于获得在细胞培养物中生产的肝素结合蛋白的方法。本发明包括用于回收和纯化重折叠的肝素结合蛋白的方法，该蛋白质在原核宿主细胞中生产并且存在于这些细胞中，典型地存在于周质空间或胞内空间。该在原核宿主细胞中生产的肝素结合蛋白还可以被发现作为可溶性蛋白质或者可溶性和不溶性蛋白质的混合物。发明背景已知一大批天然存在的、有生物学活性的多肽能结合肝素。这样的肝素结合多肽包括细胞因子，诸如血小板因子4和IL-8(Barberetal.，(1972)Biochim.Biophvs.Acta,286:312-329;Handinetal.，(1976)J.Biol.Chem.'251:4273-422;Loscalzoetal.,(1985)Arch.Biochem.Biophys.,240:446-455;Zuckeretal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7571-7574;Talpasetal.,(1991)Biochim.Biophys.Acta,1078:208-218;Webbetal"(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7158-7162);肝素结合生长因子(BurgessandMaciag,(1989)Annu.Rev.Biochem.,58:576-606;Klagsbrun,(1989)Prog.GrowthFactorRes.,1:207-235),诸如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和肝细胞生长因子(HGF)(Liuetal.，(1992)Gastrointest.LiverPhysiol.,26:G642-G649);及选择蛋白，诸如L-选择蛋白、E-选择蛋白和P-选择蛋白(Norgard-Sumnichtetal.，(1993)Science,261:480-483)。还可参见Mu腿andLinhardt,(2004)ArteriosclerThrombVaseBiol.,24:1549-1557。国际公布号WO95/07097记载了用于治疗用途的肝素结合蛋白配制剂，其包括肝素结合生长因子诸如VEGF及纯化的天然肝素或其它聚阴离子化合物。肝素衍生的寡糖和各种其它聚阴离子化合物已经显示出稳定肝素结合生长因子的活性构象(Barzuetal.,(1989)J.Cell.Physiol.,140:538-548;Daboraetal.，(1991)J.Biol.Chem.,266:23627-23640)，而且肝素亲和层析已经用于各种纯化方案(通常地参见国际公布号WO96/02562)。许多哺乳动物起源的肝素结合蛋白已经通过重组技术来生产，而且在临床上是重要的(MunozandLinhardt,(2004)ArteriosclerThrombVaseBiol.,24:1549-1557;Favardetal.(1996)DiabetesandMetabolism,22(4):268-73;Matsudaetal.,(1995)J.Biochem.,118(3):643-9;Robertsetal"(1995)BrainResearch,699(1):51-61)。例如，VEGF是血管内皮细胞的有效促细胞分裂剂。它又称为血管通透因子(VPF)。参见Dvoraketal.,(1995)Am.J.Pathol.,146:1029-39。VEGF在血管生成(vasculogenesis)(即胚胎维管结构的发育)和血管发生(angiogenesis)(即从原有的血管形成新血管的过程)中都扮演了重要角色。参见例如Ferrara,(2004)EndocrineReviews,25(4):581-611;Risauetal"(1988)Dev.Biol.,125:441-450;Zachary，(1998)Intl.J.BiochemCellBio.,30:1169-1174;Neufeldetal.,(1999)FASEBJ.,13:9-22;Ferrara(1999)J.Mol.Med.,77:527-543;FerraraandDavis-Smyth,(1997)Endocri.Rev.,18:4-25。VEGF的临床应用包括那些其中新毛细血管床的生长指示为例如促进伤口愈合的(参见例如国际公布号WO91/02058;律师记事号P2358R1,题为"WoundHealing",于2006年6月16日提交)、促进组织生长和修复的，例如肝(参见例如W02003/0103581)、骨(参见例如W02003/094617)等。还可参见Ferrara,(2004)EndocrineReviews,25(4):581-611。典型地，治疗上重要的重组蛋白在各种宿主生物体中生产。大多数蛋白质可以在真核宿主诸如CHO细胞中以它们天然形式表达。动物细胞培养物通常要求延长生长时间以实现最大细胞密度并最终获得比原核细胞培养物低的细胞密度(Cleland,J.(1993)ACSSymposiumSeries526,ProteinFolding:InVivoandInVitro,AmericanChemicalSociety)。另夕卜，动物细胞培养物经常要求昂贵的培养基，其包含可能干扰所需蛋白质回收的培养组分。细菌宿主表达系统为生产规模的重组蛋白生产提供了有成本效益的替代方案。有许多关于重组蛋白的常规细菌表达的美国专利，包括美国专利号4,565，785;4,673,641;4,795,706;4,710,473。该生产方法的一个主要优点是通过离心或孩t滤容易地从细胞组分中分离产物的能力。参见例如KipriyanovandLittle,(1999)MolecularBiotechnology,12:173-201;SkerraandPluckthun,(1988)Science,240:1038-1040。重组肝素结合生长因子诸如酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子已经从包括细菌在内的许多来源中回收和纯化(SalterD.H.etal.，(1996)Labor.Invest.,74(2):546-556(VEGF);Siemeisteretal.，(1996)Biochem.Biophvs.Res.Commun.,222(2):249匿55(VEGF);Caoetal.，(1996)J.Biol.Chem.,261(6):3154-62(VEGF);Yangetal.,(1994)GaoiishuTongxun,4:28-31(VEGF);Anspachetal.，(1995)J.Chromatogr.A,711(1):129隱139(>FGF&bFGF);Gaulandris(1994)JCell.Physiol.,161(1):149画59(bFGF);EstapeandRinas(1996)Biotech.Tech.,10(7):481画484(bFGF);McDonaldetal.，(1995)FASEBJ.，9(3):A410(bFGF》。然而，细菌表达系统诸如大肠杆菌缺乏促进蛋白质正确重折叠的细胞机制，并且通常不导致大蛋白质分泌进入培养基。在细菌宿主细胞中表达的重组蛋白经常发现是包涵体，其由部分折叠的和错误折叠的还原的蛋白质的密实块组成。在这种形式中，重组蛋白通常是无活性的。例如，VEGF的主要活性形式是两条165个氨基酸的多肽(VEGF-165)的同二聚体。在这种结构中，每个亚基包含7对链内二硫键和实现两个亚基的共价连接的另外两对(Ferraraetal.，(1991)^Cell.Biochem.,47:211-218)。天然构象包括一个强》咸性结构域，其已经显示出易于结合肝素(Ferrara等人(1991)同上)。VEGF的共价二聚化是有效的受体结合和生物学活性所需要的(P6tgensetal.,(l994)J.Biol.Chem.,269:32879-32885;Claffeyetal.,(1995)Biochim.etBiophvs.Acta,1246:1-9)。细菌产物潜在地包含数个错误折叠的和二硫化物混乱的中间体。另外，重折叠经常产生错误折叠的和二硫化物连接的二聚体、三聚体、和多聚体(Morrisetal.,(1990)Biochem.J.,268:803-806;Torenetal.，(1988)Anal.Biochem.、169:287-299)。这种締合现象在蛋白质重折叠期间是非常普通的，特别是在较高的蛋白质浓度，而且经常出现为牵涉经由部分折叠的中间体的疏水相互作用的締合(ClelandandWang,(1"0)Biochemistry,29:11072-11078)。错误折叠发生于发酵期间的细胞中或分离规程中。从周质空间或胞内空间回收的蛋白质必须溶解，而且可溶性蛋白质必须重折叠成天然状态。用于重折叠蛋白质成为正确的、有生物学活性的构象的体外方法对于获得功能性蛋白质是至关重要的。回收自包涵体的蛋白质的典型下游加工包括在高浓度的变性剂诸如尿素溶解包涵体，接着稀释变性剂以允许发生重折叠(参见美国专利号4,512，922;4,511,502;4,511,503)。还可参见例如RudolphandLilie,(1996)FASEBJ.,10:49-56;Fischeretal.，(1993)BiotechnologyandBioengineering,41:3-13。这样的回收方法被认为是在略微改变后普遍适用于从包涵体中回收有生物学活性的重组蛋白。这些方法已经应用于肝素结合蛋白诸如VEGF(Siemdster等人(1996)同上)。这些方法试图消除随机二硫化物成键，之后通过它的其它稳定力使重组蛋白变成它的生物学活性构象，而且可以不消除不正确折叠的中间体或提供正确折叠产物的均质群。通过将单一蛋白质封装在胶团内或者在树脂上分离它们然后除去变性剂，反胶团(reversedmicelle)或离子交换层析已经用于帮助变性蛋白质的重折叠(Hagenetal.,(1990)Biotechnol.Bioeng.,35:966-975;Creighton(1985)于ProteinStructureFoldingandDesign(Oxender,D丄.Ed.)pp.249-251,NewYork:AlanR.Liss，Inc.)。这些方法已经用于防止蛋白质聚集和促进正确重折叠。为了改变重折叠的速率或程度，已经用配体和针对蛋白质天然结构的抗体实施了构象特异性重折叠(ClelandandWang,(1993),于Biotechnology,(RehmH.-J"andReedG.Eds.)pp528-555，NewYork,VCH)。例如，肌酸激酶在存在针对其天然结构的抗体时重折叠(Morrisetal.,(1987)Biochem.J.,248:53-57)。在抗体之外，配体和辅因子已经用于增强重折叠。这些分子在天然蛋白形成之后更有可能与折叠中的蛋白质相互作用。因此，可以将折叠平衡向天然状态"驱动"。例如，血红素铁的轴向位置的外在配体提高了亚铁细胞色素c的重折叠速率(BremsandStellwagon，(1983)J.Biol.Chem.,258:3655-3661)。倡伴蛋白也已经用于帮助蛋白质折叠。参见例如Baneyx,(1999)CurrentOpinioninBiotechnology,10:411-421。需要从宿主细胞培养物中折叠和/或回收肝素结合蛋白的新的和更有效的方法，例如用于在细菌细胞培养物中高效地和经济地生产肝素结合蛋白，从而提供无生物学活性的中间体的消除或减少及高度纯化的、有生物学活性的、正确重折叠的蛋白质的回收的改善，而且普遍适用于生产规^^莫的蛋白质生产。本发明满足了这些需要和其它需要，在阅读以下公开内容后将是显而易见的。发明概述本发明提供了一种用于从细胞培养物中回收并纯化重折叠的肝素结合蛋白的方法。具体而言，本发明提供了一种从原核宿主细胞(例如细菌细胞)中回收肝素结合蛋白的方法。例如，一种方法包含以下步骤(a)从所述细菌细胞的周质空间或胞内空间分离不溶性肝素结合蛋白；(b)在包含离液剂和还原剂的第一緩冲溶液中溶解所述分离的不溶性肝素结合蛋白；(c)在包含离液剂和硫酸化聚阴离子试剂的第二緩冲溶液中温育所述溶解的肝素结合蛋白，温育的时间和条件使得肝素结合蛋白发生重折叠；并(d)回收所述重折叠的肝素结合蛋白，其中与对照相比通过有硫酸化聚阴离子试剂的温育而回收的蛋白质浓度增加了2到10倍。在一个实施方案中，所述第二緩沖溶液进一步包含精氨酸。在一个实施方案中，所述第二緩沖溶液进一步包含半胱氨酸或温和的还原剂。在本发明的一个实施方案中，所回收的有生物学活性的、重折叠的蛋白质的蛋白质浓度增加了例如2-8倍，或者所回收的有生物学活性的、重折叠的蛋白质的蛋白质浓度增加了2-5倍，或者所回收的有生物学活性的、重折叠的蛋白质的蛋白质浓度增加了3-5倍，或者所回收的有生物学活性的、重折叠的蛋白质的蛋白质浓度增加了2-3倍。在本发明的另一个实施方案中，所回收的有生物学活性的、重折叠的蛋白质的蛋白质浓度增加了例如大于2.0倍、2.5倍、2.8倍、3.0倍、5倍、6倍、7.0倍、8倍、9倍等。在本发明的一个实施方案中，有生物学活性的、重折叠的VEGF的蛋白质浓度增加了3至5倍。本发明的方法广泛适用于肝素结合蛋白，尤其是肝素结合生长因子，特别是血管内皮生长因子(VEGF)。在本发明的某些实施方案中，所述硫酸化聚阴离子试剂在大约3，000和10,000道尔顿之间。在一个实施方案中，生产过程中所使用的所述硫酸化聚阴离子试剂是硫酸右旋糖苷、硫酸钠或硫酸肝素。在一个方面，硫酸右旋糖苦在3,000道尔顿和10，000道尔顿之间。另外，本发明提供了用于纯化肝素结合蛋白的工序和方法，或是单独的或是联合肝素结合蛋白的回收，正如本文中所描述的。在一个特定的实施方案中，纯化方法包括使所述重折叠的肝素结合蛋白接触羟磷灰石层析支持物、第一疏水相互作用层析支持物、阳离子层析支持物、和第二疏水相互作用层析支持物，并且从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。在另一个实施方案中，纯化方法包括使所述重折叠的肝素结合蛋白接触阳离子交换支持物、第一疏水相互作用层析支持物、和离子交换或混合介质层析支持物，并且从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。设想了可以以任意次序实施回收步骤的各步骤，例如顺序的或改变层析支持物的次序。在本发明的某些实施方案中，提供了从生产或工业规模的细胞培养物中回收并纯化重折叠的肝素结合蛋白的方法。附图简述图l显示了由细菌菌株W3110生产的VEGF加载到POROSHE2/M柱(4.6x100mm,PerSeptiveBioResearchProducts,Cambridge,MA)上的层片斤图。例如，POROSHE/2M柱在含0.15M氯化钠的10mM磷酸钠pH7中平衡。使用10分钟的10mM磷酸钠pH7中的0.15-2M氯化钠的线性梯度洗脱该柱。在280nm监测洗提液。在每个峰中回收的蛋白质对应于VEGF，然而只有峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图2显示了表明肝素对天然的、正确折叠的VEGF的稳定作用的曲线图。VEGF悬浮在含5mMEDTA、0.2MNaCl和10mM半胱氨酸的50mMHEPESpH8。图3A-3D显示了由细菌菌株W3110生产的，且与12^g/ml5,000道尔顿硫酸右旋糖苷(图3A)、12|ig/ml8,000道尔顿硫酸右旋糖苷(图3B)、12吗/mlIO，OOO道尔顿硫酸右旋糖苷(图3C)或"吗/ml3，000道尔顿肝素(图3D)—起温育的，且加载到POROSHE2/M柱(4.6x100mm,PerSeptiveBioResearchProducts,Cambridge,MA)上的VEGF的层析图。例如，该柱在含0.15M氯化钠的10mM磷酸钠pH7中平衡。使用10分钟的10mM磷酸钠pH7中的0.15-2M氯化钠的线性梯度洗脱该柱。在280nm监测洗提液。在每个峰中回收的蛋白质对应于VEGF,然而只有峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图4显示了规模对VEGF重折叠的影响。图5显示了低分子量和高分子量(MW)的肝素及10，000道尔顿的硫酸右旋糖苷对VEGF重折叠的影响。峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图6显示了硫酸钠对VEGF重折叠的影响。峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图7显示了低分子量和高分子量(MW)肝素及5,000道尔顿、8,000道尔顿和10,OOO道尔顿的硫酸右旋糖苷对VEGF重折叠的影响。峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图8显示了肝素和硫酸右旋糖苷对VEGF重折叠的影响。峰3对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF。图9显示了尿素和DTT对从细菌包涵体中抽提VEGF的影响。图IO显示了尿素和DTT浓度对VEGF重折叠的影响。图1l显示了VEGF!65的氨基酸顺序，其中标明了二碌^4(SEQIDNO:1)。图12显示了带电荷的氨基酸的存在的影响。当第二緩沖溶液中的浓度为0.75M时，精氨酸和赖氨酸两者都是有益的，而，与不含組氨酸的緩沖溶液相比，组氨酸具有少许叠加效应。另外，精氨酸已经显示出在0.1到1M的浓度具有相似的影响。图13显示了重折叠百分比效率的稀释效应，其中，虽然总VEGF浓度随稀释度增加而减低，但是重折叠百分比效率随稀释度增加而升高。发明详述定义"肝素，，(heparin或heparinicacid)是高度硫酸化的、直链阴离子粘多糖(称作糖胺聚糖)的异质群。虽然可以存在其它糖类，肝素中的主要糖类是a-L-艾杜糖醛酸2-硫酸酯、2-脱氧-2-磺氨基-a-葡萄糖6-好u酸酯、P-D-葡萄糖醛酸、2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-葡萄糖、和L-艾杜糖醛酸。这些和任选的其它糖类通过糖苷键相连，形成不同大小的多聚体。由于其共价连接的硫酸酯和羧酸基团的存在，肝素是强酸性的。肝素的分子量的范围从大约3，000到大约20，000道尔顿，取决于来源和测定方法。天然的肝素是多个组织的组分，尤其是肝和肺，以及数个哺乳动物物种中的肥大细胞。肝素和肝素盐(肝素钠)可商购，而且主要在各种临床情况中用作抗凝血剂。"硫酸右旋糖苦"是右旋糖普的硫酸酯，其主要结构是D-葡萄糖的多聚体。葡萄糖和任选的其它糖类通过a-D(l-6)糖苷键相连，形成不同大小的多聚体。由于共价连接的硫酸酯的存在，硫酸右旋糖苷是强酸性的。硫含量通常不少于10%，典型地大约15%-20%,直到每个葡萄糖分子有3个碌u酸基团。硫酸右旋糖苦的平均分子量从大约1，000到大约40,000,000道尔顿。本发明中可采用的硫酸右旋糖苷的例子包括由微生物诸如肠膜明串珠菌(丄ewco"wtocm^e"fera/tfes)和葡聚糖明串珠菌(丄.tte^ram'cww)产生的右旋糖苷的碌b酸酯。"聚阴离子试剂，，在本发明范围内使用时是指可商购的纯化的天然的肝素制品以及能够与肝素结合蛋白结合的化合物，包括其它"聚阴离子试剂"，诸如硫酸钠、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、(多)硫酸戊聚糖、右旋糖苷、硫酸右旋糖苷、透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、和硫酸角质素。在本发明的内容中特别有用的是"硫酸化聚阴离子试剂"，诸如例如多糖的硫酸酯衍生物，诸如硫酸肝素、硫酸右旋糖香、由诸如美国专利号5,314，872中记载的软化芽孢杆菌(5a"7/zwmacerara)这样的微生物产生的环糊精的硫酸酯、以及其它葡聚糖的硫酸酯诸如(3-l,3葡聚糖硫酸酯(P-l,3葡聚糖是由属于产碱菌属G4/c^/z;gewe力或土壤杆菌属04graZ^c^7'M—的微生物产生的)、及硫酸软骨素以及硫酸化肝素片段。上述试剂通常是本领域技术人员可得到的和认可的。例如，碌u酸化肝素片段可以从已经通过凝胶渗透层析分级的肝素衍生寡糖文库中获得。亲和分级的、肝素衍生的寡糖的制备见Ishiharaetal.,(l993)J.Biol.Chem.,268:4675-4683。这些寡糖是从商品化猪肝素制备的，用亚硝酸部分解聚，用硼氢化钠还原，并通过凝胶渗透层析分级。所得二糖、四糖、六糖、八糖、和十糖集合顺序施加至共价附着于SEPHAROSETM4B的人类重组bFGF的亲和柱，并根据它们应答氯化钠梯度而从该柱上的洗脱进一步分级成子集合。这产生了五个集合，命名为Hexa-l到Hexa-5，进一步评估其结构和生物学活性。Hexa-5C的结构及其500MHzNMR谱见Tyrelletal.,(1993)J.Biol.Chem.,268:4684-4689的图4。这种六糖具有如下结构[IdoA(2-OS03)al-4GlcNS03(6-OS03)al-4]2IdoA(2-OS03)al-4AManR(6-OS03)。上文讨论到的所有肝素衍生寡糖以及其它肝素样寡糖都适用于和可用于本发明。在本发明的一个实施方案中，使用六糖和更高单位大小的肝素多糖(例如七糖、八糖、九糖和十糖)。此外，使用具有大的净负电荷(例如由于高度的硫酸化作用所致)的肝素衍生的或肝素样的寡糖是有益的。术语"肝素结合蛋白"或"HPB"在用于本文时是指能够结合肝素(如上文所定义的)的多肽。该定义包括天然的和重组生产的肝素结合蛋白的成熟、前(pre)、前-原(pre-pro)、和原(pro)形式。肝素结合蛋白的典型例子是"肝素结合生长因子"，包括但不限于表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)(又称为散射因子，SF)、和神经生长因子(NGF)、IL-8等。在用于本文时"血管内皮生长因子"或者"VEGF"是指最初衍生自牛垂体滤泡细胞的一种哺乳动物生长因子，其氨基酸顺序^L露于Castor，C.W.,etal.，(1991)MethodsinEnzvmol.,198:391-405，及其具有相应天然VEGF定性生物学活性的功能性衍生物，包括但不限于Houcketal.,(1991)Mol.Endocrin.,5:1806-1814报道的人类VEGF氨基酸序列。还可参见Leungetal.，(1989)Science,246:1306;Robinson&Stringer,(2001)JournalofCellScience,144(5):853-865;美国专利号5，332，671。VEGF的主要形式是165个氨基酸的同二聚体，其具有十六个半胱氨酸残基，它们形成7个分子内二硫键和两个分子间二辟"建。可变剪接牵涉由121、145、165、189和206个氨基酸组成的多种人类VEGF多肽的形成，然而VEGF^变体缺乏其它变体的肝素结合结构域，因此不在本文所列肝素结合蛋白定义的范围内。VEGF的所有同工型(isoform)分享共同的氨基末端结构域，但是分子的羧基末端部分的长度不同。优选的VEGF活性形式，VEGF165,在每个单体中在以下氨基酸残基之间具有二硫键Cys26画Cys68;Cys57-Cysl04;Cys61-Cysl02;Cysll7隱Cys135;Cysl20-Cysl37;Cysl39-Cysl58;Cysl46-Cys160。参见图ll。还可参见例如Kecketal.，(1997)ArchivesofBiochemistryandBiophysics,344(1):103-113。VEGF,65分子由两个结构域构成一个氨基末端受体结合结构域(氨基酸1-110，二石充4泉相连的同二聚体)和一个羧基末端肝素结合结构域(残基lll-165)。参见例如Keytetal.，(1996)J.Biol.Chem.,271(13):7788-7795。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF,65在残基75(Asn)处不是糖基化的。参见例^口Yangetal.，(1998)JournalofPharm.&ExperimentalTherapeutics,284:103-110。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF附在残基Asnl0处是基本上未脱酰胺基的。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF,65是脱酰胺基的(在残基AsnlO处)与未脱酰胺基的蛋白质的混合物，典型地大部分蛋白质是未脱酰胺基的。既然VEGF,65是同二聚体，那么脱氨基作用可以发生在一条或所有两条多肽链上。在用于本文时，"正确折叠的"或"有生物学活性的"VEGF或其它HBP等等指具有生物学活性构象的分子。熟练技术人员会认可，错误折叠的和二石克一睫混乱的中间体可能具有生物学活性。在这种情况下，正确折叠的或有生物学活性的VEGF或HBP相当于天然折叠模式的VEGF(上文所述的)或其它HBP。例如，在二聚体分子中的两个分子间二石危键之外，正确折叠的VEGF具有上文所述的二硫化物对，然而其它中间体可以通过细菌细胞培养物来生产(图1和3A-3D)。对于正确折叠的VEGF，所述两个分子间二硫键发生在每个单体的相同残基，即Cys51和Cys60之间。参见例如WO98/16551专利。VEGF的生物学活性包括但不限于例如促进血管通透性、促进血管内皮细胞生长、与VEGF受体结合、结合VEGF受体并通过VEGF受体发信号(参见例如Keytetal.,(1996)JournalofBiologicalChemistry,271(10):5638-5646)、诱导血管发生等。术语"纯化的"或"纯的HBP"等等指不含通常在其重组生产中，尤其在原核或细菌细胞培养物中发现的伴随物质的材料。如此，该术语指不含污染性DNA、宿主细胞蛋白质或与其原位环境相关的其它分子的重组HBP。该术语指至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约卯％、至少大约95%或至少大约98%或更高的纯度。术语"包涵体"或"折射体"指聚集的感兴趣多肽的密集胞内块，其构成总细胞蛋白质的重大部分，包括所有细胞组分。在有些情况中，但不是所有情况，这些多肽聚集体在降至1,000倍放大率的相差显微镜下可识别为细胞外壳内明显的亮点。在用于本文时，术语"错误折叠的"蛋白质指折射体内包含的沉淀的或聚集的多肽。在用于本文时，"不溶性的"或"错误折叠的"VEGF或其它HBP指沉淀的或聚集的VEGF，其包含在原核宿主细胞的周质空间或胞内空间内，或者以其它方式与原核宿主细胞相关，且呈现出无生物学活性的构象，具有错配的或未形成的二硫键。不溶性HBP通常是但非必然是包含在折射体中的，即在相差显微镜下它可以是或可以不是明显的。在用于本文时，"离液剂"指在水溶液中有合适浓度时，能够通过多肽表面的变化而改变多肽的空间构型或构象从而使多肽可溶于该水性介质的化合物。所述变化可以通过改变例如水合状态、溶剂环境、或溶剂-表面相互作用而发生。离液剂的浓度将直接影响它的强度和效力。强变性的离液溶液在溶液中包含高浓度的离液剂，将有效地使溶液中存在的多肽解折叠，乂人而有效地消除该蛋白质的二级结构。解折叠可以是相对广泛的，但是可逆的。中等变性的离液溶液在溶液中包含足够浓度的离液剂，允许多肽从无论怎样的扭曲构象(该多肽通过在溶液中可溶的中间体所呈现的)部分折叠成这样它找到它自己。离液剂的例子包括盐酸胍、尿素、和氢氧化物诸如氢氧化钠或氢氧化钾。离液剂包括这些试剂的组合，诸如氢氧化物与尿素或盐酸胍的混合物。在用于本文时，"还原剂"指在水溶液中有合适浓度时，维持游离巯基，使得分子内或分子间二硫键遭到化学破坏的化合物。合适的还原剂的代表性例子包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、(3-琉基乙醇(BME)、半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐/酯、谷胱甘肽、三[2-羧乙基]膦(TCEP)、和硼氩化钠。在用于本文时，"緩沖溶液"指通过其酸-碱共轭(corijugate)组分的作用而耐受pH变化的溶液。"细菌，，为了本文包括真细菌和古细菌。在本发明的某些实施方案中，本文所述方法和工艺中使用真细菌，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在本发明的一个实施方案中，使用革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科。属于肠杆菌科的细菌的例子包括埃希氏菌属(j^c/zeWc/z/a)、肠杆菌属C&ferakzcte。、欧文氏菌属(五rw'm'(3)、克雷伯氏菌属(《/e6wW/a)、变形菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、和志贺氏菌属(幼/^//0)。其它类型的合适细菌包括固氮菌属(JzotoZ)acteO、假单胞菌属、才艮瘤菌属(i/2/zoZu'fl)、透明颤菌属(W&easc/〃a)、和副J求菌属(尸aracoccw"。在本发明的一个实施方案中，4吏用大肠杆菌。合适的大肠杆菌宿主包括大肠杆菌W3110(ATCC27,325)、大肠杆菌294(ATCC31,446)、大肠杆菌B、和大肠杆菌X1776(ATCC31,537)。这些例子是例示性的，而不是限制性的，而且W3110是一个例子。也可以采用任何上述细菌的突变细胞。当然，在选择细胞时考虑复制子在细菌细胞中的复制性是必要的。例如，在使用本领域公知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177、或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可以合适地用作宿主。关于合适细菌宿主细胞的例子还可参见下文。在用于本文时，表述"细胞"、"细胞系"、"菌抹"和"细胞培养物"可互换使用，而且所有这类名称都包括后代。如此，词语"转化子/转化体"和"转化细胞"包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管转移的次数。还应理解，由于有意的或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上不是精确相同的。在最初转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代包括在内。若想做出不同的命名，上下文会有清楚的表述。在用于本文时，"多肽"通常指来自任何细胞来源的、具有多于大约十个氨基酸的肽和蛋白质。"异源的"多肽是那些对所使用的宿主细胞而言是外来的多肽，诸如由大肠杆菌生产的人类蛋白质。虽然异源的多肽可以是原核的或真核的，但是优选它是真核的，更优选是哺乳动物的，最优选是人类的。在本发明的某些实施方案中，它是重组生产的或重组的多肽。肝素结合蛋白分离肝素结合蛋白不溶性的、错误折叠的肝素结合蛋白(HBP)通过任何本领域标准技术分离自表达该蛋白质的原核宿主细胞。例如，在合适的分离緩冲液中分离不溶性HBP，即将细胞暴露于合适离子强度的緩沖液以溶解大部分宿主蛋白质，但是在该溶液中受试蛋白质基本上是不溶性的，或者破碎细胞以从周质空间或胞内空间释放包涵体或蛋白质并且使得它们可通过例如离心来回收。这种技术是公知的，记载于例如美国专利号4，511，503。Kleid等人披露了通过匀浆继之以离心来纯化折射体(Kleidetal.,(1984)于DevelopmentsinIndustrialMicrobiology,(SocietyforIndustrialMicrobiology,Arlington,VA)25:217-235)。还可参见例如Fischeretal.,(1993)BiotechnologyandBioengineering，41:3-13。美国专利号5,410，026记载了一种用于从包涵体中回收蛋白质的典型方法，并且概括如下。将原核细胞悬浮在合适的緩冲液中。典型地，緩冲液包含适于在pH5到9、或大约6到8之间进行緩沖的緩沖剂和盐。任何合适的盐，包括NaCl，可用于在该緩冲溶液中维持足够的离子强度。典型地，釆用大约0.01到2M或0.1到0.2M的离子强度。细胞在悬浮在此緩冲液中时使用通常采用的技术破裂或溶解，诸如例如机械的方法，例如均质器(Manton-Gaulinpress、Microfluidizer、或Niro-Soavi)、弗氏压碎器(Frenchpress)、玻珠研磨机、或声波振荡器，或者通过化学的或酶学的方法。化学的或酶学的破裂细胞方法的例子包括成原生质球，其中必须使用:;容菌酶来溶解细菌壁(H.Neuetal.,(1964)Biochem.Biophys.Res.Comm.,17:215);和渗压震扰，其中牵涉将活细胞用高张度的溶液处理并用低张度的冷水清洗以释放多肽(H.Neuetal.,(1965)J.Biol.Chem.,240(9):3685-3692)。通常使用超声处理来破裂分析规模体积的发酵肉汤中所包含的细菌。在更大的规模上，典型的采用高压匀浆。在细胞破裂之后，典型地将悬浮液在标准离心机中低速离心，一般在大约500到15，000xg左右，例如在本发明的一个实施方案中采用大约12,000xg，离心的时间足以使基本上所有的不溶性蛋白质沉淀。这类时间可以简单地确定，并且取决于离心的体积和离心的设计。典型地，大约10分钟到0.5小时足以沉淀不溶性蛋白。在一个实施方案中，将悬浮液以12,000xg离心10分钟。所得沉淀物包含基本上所有的不溶性蛋白部分。如果细胞破裂工序是不完全的，那么该沉淀物可能还包含完整细胞或破裂的细胞碎片。细胞破裂的完全性可以通过在少量的相同緩冲溶液中重悬浮所得沉淀物并用相差显微镜检查该悬浮液而测定。破裂细胞碎片或完整细胞的存在指示进一步的超声处理或其它破裂手段是除去碎片或细胞及相关的非折射性多肽所必需的。在这样的进一步破裂之后，如果需要的话，再次离心悬浮液并回收沉淀物，再悬浮，并再检验。重复该工序直到直观检验揭示了沉淀的物质中没有破裂的细胞碎片或直到进一步处理没能减少所得沉淀物的体积。无论不溶性蛋白质是细胞内的或在周质空间中都可以采用上述的方法。在本发明的一个实施方案中，本文中所给出的用于分离肝素结合蛋白的条件是针对沉淀在周质空间或胞内空间中的包涵体的，而且特别涉及VEGF。然而，认为所述工艺和规程在如下所述略微变更后总体适用于肝素结合蛋白。在本发明的某些实施方案中，所述工艺和规程适用于HBP的生产或工业规模的生产、重折叠、和纯化。重折叠肝素结合蛋白将分离的不溶性的、错误折叠的肝素结合蛋白在第一緩冲溶液中温育，该第一緩冲溶液包含一定量的离液剂和还原剂，足以基本上溶解该肝素结合蛋白。此温育在允许一些或基本上所有肝素结合蛋白发生溶解并解折叠的浓度、温育时间、和温育温度的条件下进行。緩冲溶液中溶解程度的测量可以简单地测定和适当地实施，例如通过浊度测定、通过分析离心后上清液和沉淀物之间的分级、通过还原性SDS-PAGE、通过蛋白质测定法(例如Bradford试剂蛋白质测定法(例如Pierce、Bio-Rad等))、或通过HPLC。所述第一緩冲溶液包含适于将緩沖液的pH范围维持在至少大约7.0、典型范围7.5-10.5的緩冲剂。在一个实施方案中，用于VEGF的pH是pH8.0。能提供后一种范围内的pH的合适緩冲剂的例子包括TRIS-HC1(三[羟曱基]氨基曱烷)、HEPPS(N-[2-羟乙基]哌。秦-N'-[3-丙烷-磺酸])、HEPES(N-[2-羟乙基]哌溱-N'-[2-乙烷磺酸])、CAPSO(3-[环己基氨基]-2-羟基-l-丙烷磺酸)、AMP(2-氨基-2-曱基-l-丙醇)、CAPS(3-[环己基氨基]-l-丙烷磺酸)、CHES(2-[N-环己基氨基]乙烷磺酸)、甘氨酸、和乙酸钠。在本发明的一个实施方案中，本文中的緩冲剂是大约pH8.0的HEPPS。在又一个实施方案中，所述緩沖剂，诸如HEPPS,是硫酸化的。适于实施本发明的离液剂包括例如尿素和胍或石克氰酸的盐，例如尿素、盐酸胍、硫氰酸钠等。緩沖液中必需存在的离液剂的量是足以在溶液中解折叠HBP的量。在本发明的某些实施方案中，离液剂在大约4和10摩尔之间存在。在本发明的一个实施方案中，离液剂是大约5-8M、或大约7M的尿素。在另一个例子中，离液剂是大约6-8M的盐酸胍。合适的还原剂的例子包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、(3-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸、DTE等。緩冲液中存在的还原剂的量将主要取决于还原剂和离液剂的类型、所采用的緩冲液的类型和pH、溶液中包含或引入的氧的量、及緩冲液中蛋白质的浓度。例如，对于pH7.0-10.0的緩沖溶液中有0.5-1.5mg/ml蛋白质，该緩冲溶液包含4-8M尿素和如下还原剂，例如浓度大约l-15mM的DTT、或浓度大约0.2-2mM的BME、或浓度大约2-10mM的半胱氨酸。在一个实施方案中，还原剂是浓度大约0.5到大约4mM、或2-4mM的DTT。图9显示了尿素和DTT对抽提VEGF的影响。峰3的VEGF代表了正确折叠的、有生物学活性的VEGF。在一个实施方案中，还原剂是大约1OmM的DTT。本文中的緩冲液可以使用单一还原剂或还原剂的组合。緩沖溶液中的蛋白质浓度必须使得根据光密度的测定来看该蛋白质充分溶解。采用的精确量将取决于例如緩沖溶液中其它成分的浓度和类型，特别是蛋白质的浓度、还原剂、和緩沖液的pH。在本发明的一个实施方案中，肝素结合蛋白的浓度范围是0.5-5.5mg/ml，或1.5-5.0mg/ml。溶解典型地在大约0-45。C、或大约20-40。C、或大约23-37。C、或大约25-37。C、或大约25。C进行至少大约l-24小时。在一个实施方案中，溶解在室温进行至少大约2小时。典型地，温度不会受到盐、还原剂和离液剂水平的明显影响。在多肽溶解之后，将它置于第二緩沖溶液中或者在第二緩沖溶液中稀释，该第二緩沖溶液中包含如上所述的离液剂和硫酸化聚阴离子试剂，无论如何离液剂的浓度要允许肝素结合蛋白重折叠。可溶性的、错误折叠的蛋白质的此第二温育的条件通常使得一些或基本上的或全部的蛋白质发生重折叠。确切的条件将取决于例如緩沖液的pH及存在的硫酸化聚阴离子试剂和离液剂和还原剂的浓度和类型，如果有的话。温育温度通常是大约0-40。C、或10-40。C,而且温育通常进行至少大约l小时以实现重折叠。在一个实施方案中，该反应在例如大约15-37。C或20-30。C进行至少大约6小时、至少大约10小时、或大约10和48小时之间、或大约15和20小时之间、或6和20小时之间、或12和24小时之间。重折叠的程度如下合适的测定，即通过HPB的放射免疫测定法(RIA)滴度或者通过4吏用例如POROSHE2/M柱(PerSeptiveBioResearchProducts)或其它合适的肝素亲和柱的高效液相层析(HPLC)分析。RIA滴度或正确折叠HBP峰大小升高直接对应于存在于緩沖液中的正确折叠的、有生物学活性的HPB的量升高。进行温育以最大化所回收的正确折叠HPB对错误折叠HPB的比率，其通过RIA或HPLC来测定。在一个实施方案中，正确折叠的VEGF的质量和数量使用肝素结合测定法来评估。将包含稀释的肝素结合蛋白的样品加载到例如POROSHE2/M柱(4.6x層mm，PerSeptiveBioResearchProducts,Cambridge,MA)或其它合适的肝素亲和柱上。例如，在包含O.15M氯化钠的10mM磷酸钠pH7中平衡肝素亲和柱。以lml/min或2ml/min的流速，使用IO分钟的10mM磷酸钠pH7中的0.15-2M氯化钠线性梯度洗脱该柱。在280nm处监测洗提液。在一个实施方案中，在对应于有生物学活性的、正确重折叠的HBP的单一峰中回收蛋白质。在本发明的一个实施方案中，用于测定正确重折叠的HBP的测定法是RPHPLC。任选地，可以通过肽图来证实二石克键连接。圆二色性也可用于测定二维和三维结构"斤叠。用于第二緩冲溶液的緩冲剂可以是任何上文关于第一緩沖溶液所列的，例如HEPPSpH8.0，例如浓度大约50mM,用于重折叠VEGF。可以用重折叠緩冲液稀释多肽，例如至少5倍、或至少大约10倍、大约20倍、或大约40倍。或者，可以将多肽对重折叠緩冲液进行透析。第二緩冲溶液包含离液剂，该离液剂的浓度使得HPB发生重折叠。通常，离液剂以大约0.5和2摩尔之间的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，本文中的离液剂是尿素，其浓度是大约0.5-2M、0.5-2M、或大约1M。在一个实施方案中，离液剂是尿素，其浓度是大约1.3M。在本发明的另一个实施方案中，离液剂是盐酸胍，其浓度是大约1M。图10显示了尿素和还原剂DTT对VEGF重折叠的影响。峰3的VEGF代表了正确折叠的、有生物学活性的VEGF。如所述的，该溶液任选地还包含还原剂。还原剂合适地那些上文关于溶解步骤所述的，其浓度范围是半胱氨酸为大约0.5到大约10mM、DTT为O.l-l.OmM、和/或BME为小于大约0.2mM。在本发明的一个实施方案中，还原剂是浓度为大约0.5-2mM的DTT。在本发明的一个实施方案中，还原剂是浓度为大约0.5mM的DTT。合适的还原剂的例子包括但不限于例如二硫苏糖醇(DTT)、(3-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸、DTE等。尽管一般而言DTT和BME可以与本文中为肝素结合蛋白提供的规程联合使用，如本文所述的，大约O.l到大约10mM半胱氨酸与大约0.1到大约l.OmMDTT的组合是用于回收VEGF的一个例子。重折叠步骤包括硫酸化聚阴离子试剂，其浓度足以实现溶解的蛋白质的完全重折叠。合适的聚阴离子试剂的例子已经在上文描述了，例如多糖的硫酸化衍生物，如上文所述的硫酸化聚阴离子试剂诸如硫酸肝素、硫酸右旋糖苷、硫酸乙酰肝素、和硫酸软骨素以及硫酸化肝素片段。对于本
发明内容中所使用的硫酸肝素，分子量通常在大约3,000和10,000道尔顿之间，或者在大约3,000和6,000道尔顿之间。在本发明的一个实施方案中，在本发明的内容中采用硫酸右旋糖苷。本发明中所采用的硫酸化聚阴离子或其它试剂诸如硫酸右旋糖苷的分子量取决于所回收的具体肝素结合蛋白的大小。通常采用在大约3,000和10,000道尔顿之间的硫酸右旋糖苷。在本发明的一个实施方案中，使用大约5，000和IO，OOO道尔顿之间的硫酸右旋糖苷，例如用于VEGF的回收。在另一个实施方案中，使用大约5,000和8，000道尔顿之间的硫酸右旋糖苷来回收HBP。图3A-3D显示了使用各种浓度和分子量的硫酸右旋糖苷(图3A-C)和肝素(图3D)时的VEGF回收情况，其通过肝素亲和层析来分析。峰3对应于正确折叠的VEGF。所采用的聚阴离子化合物的浓度取决于所回收的蛋白质及其浓度和条件诸如重折叠緩冲液的温度和pH。对于硫酸钠，典型浓度在大约50和500mM之间；对于低分子量肝素，诸如6,000道尔顿的肝素(SigmaChemicalCo.),在大约10和200吗/ml之间；对于高分子量肝素，诸如猪肝素I-A(SigmaChemicalCo.)，在大约10和200昭/ml之间；及对于硫酸右旋糖苷，在大约10和400jig/ml之间或大约10和200吗/ml之间。重折叠緩沖液可任选地包含别的试剂，诸如任何非离子型去污剂，诸如TRITONX-100、NONIDETtmP-40、TWEENTM系列和BRIJtm系列。非离子型去污剂以大约在0.01%和1.0°/。之间的浓度存在。在一个例子中，非离子型去污剂的浓度在大约0.025%和0.05%之间或者大约0.05%。任选地，带正电荷的氨基酸，例如精氨酸(例如L-精氨酸/HCl)、赖氨酸等，可以存在于重折叠緩沖液中。在本发明的一个实施方案中，精氨酸的浓度是例如大约0-1000mM,或大约25到750mM，或大约50-500mM，或大约50-250mM,或大约100mM的终浓度等。在本发明的某些实施方案中，蛋白质是在pH7.0-9.0且包含终浓度0.5-3M尿素、0-30mg/L硫酸右旋糖芬、0-0.2%TritonX-IOO、2-15mM半胱氨酸、O.l-lmMDTT和0-750mM精氨酸的緩沖溶液中。在一个实施方案中，使用了50mMHEPPS。在一个实施方案中，重折叠緩沖溶液的终浓度是1M尿素、50mMHEPPS、15mg/L硫酸右旋糖苷、0.05%TritonX-100、7.5mM半胱氨酸、100mM精氨酸，pH8.0。在一个实施方案中，重折叠緩沖溶液的终浓度是1.3M尿素、50mMHEPPS、15mg/L硫酸右旋糖香、0.05%TritonX-100、7.5mM半胱氨酸、0.5mMDTT、100mM精氨酸，pH8.0。肝素结合蛋白的回收和纯化虽然从培养液中回收和纯化肝素结合蛋白可以采用用于分离此类蛋白质的各种方法和已知规程，例如盐和溶剂的分级、胶体材料的吸附、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、免疫亲和层析、电泳和高效液相层析(HPLC)，本申请描述了一种四步骤层析规程的例子，其包括使所述重折叠的肝素结合蛋白接触羟磷灰石层析支持物、第一疏水相互作用层析支持物、阳离子层析支持物和第二疏水相互作用层析支持物，并且从每个支持物上选择性洗脱该肝素结合蛋白。或者，本申请描述了另一种层析规程，其包括使所述重折叠的肝素结合蛋白接触阳离子交换支持物、疏水相互作用层析支持物和离子交换层析支持物，并且从每个支持物上选择性洗脱该肝素结合蛋白。设想了任一规程的各步骤可以以任意次序实施。在本发明的一个实施方案中，所述步骤是顺序实施的。进一步回收和纯化肝素结合蛋白中的合适的第一步骤特征性提供了肝素结合蛋白的浓缩和样品体积的减少。例如，上面所述第二温育步骤可以导致回收的肝素结合蛋白的体积大大增加及蛋白质在重折叠緩冲液中的伴随稀释。合适的第一层析支持物提供了回收的肝素结合蛋白的体积减小，并且可以有利的提供从不想要的污染性蛋白质中一定程度的纯化感兴趣蛋白质。合适的第一层析步骤包括可以洗脱并直接加载到第一疏水相互作用层析支持物上的层析支持物。例如，使用可以在适于加载至疏水相互作用层析支持物的高盐浓度中洗脱肝素结合蛋白的层析支持物。例示性的第一层析支持物包括但不限于羟磷灰石层析支持物，例如I型和II型CHT陶资(以前称为MacroPrep陶瓷)、Bio-GelHT、Bio-GelHTP(Biorad,Hercules，CA)等；金属螯合层析支持物，包括固定化金属离子诸如铜、镍等的惰性树脂；以及非衍生化硅土凝胶。在本发明的一个实施方案中，用于VEGF的纯化和回收的第一层析支持物是羟磷灰石层析支持物。在本发明的另一个实施方案中，用于VEGF的纯化和回收的第一层析支持物是阳离子交换支持物，例如下文更详细所述的。自第一层析支持物洗脱是依照本领域标准实践实现的。合适的洗脱条件和緩冲液将便于洗脱HPB直接加载到如下所述的第一疏水相互作用层析支持物上。疏水相互作用层析是本领域共知的，并且依赖分子的疏水部分与附着于"层析支持物"的疏水配体的相互作用。偶联至基质的疏水配体各式各样的称作HIC层析支持物、HIC凝胶、或HIC柱等。还应领会，蛋白质与HIC柱之间的相互作用的力量不只是蛋白质上非极性表面对极性表面的比例的函数，还是非极性表面的分布的函数。许多基质可用于制备HIC柱。最广泛使用的是琼脂糖，虽然硅土和有机聚合物树脂也可以使用。有用的疏水配体包括但不限于具有大约2到大约10个碳原子的烷基(诸如丁基、丙基、或辛基)或者芳基(诸如苯基)。用于凝胶和柱的常规HIC支持物可以商购自以下供应商，诸如GEHealthcare,Uppsala,Sweden,产品名称为丁基-SEPHAROSE、笨基-SEPHAROSEtmCL-4B、辛基SEPHAROSEFF和苯基SEPHAROSEFF及TosohCorporation,Tokyo,Japan,产品名称为TOYOPEARIJM丁基650M(FractogelTSKButyl-650)或TSK-GEL苯基5PW。在一个实施方案中，VEGF的纯化和回收所使用的第一HIC层析支持物是丁基-琼脂糖，而且第二疏水层析支持物是苯基琼脂糖。在另一个实施方案中，第一HIC层析支持物是苯基琼脂糖。配体密度是一项重要的参数，因为它不仅影响蛋白质相互作用的强度，还影响柱的容量。可商购的苯基或辛基苯基凝胶的配体密度是5-40nmol/ml凝胶床的数量级。凝胶容量是所讨论具体蛋白质以及pH、温度和盐浓度的函数，但是通常可以预计落在3-20mg/ml凝胶的范围内。具体凝胶的选择可以由熟练技术人员来确定。一般而言，蛋白质与HIC配体相互作用的强度随着烷基配体的链长而增加，但是具有大约4到大约8个碳原子的配体适于大多数分离。苯基具有与戊基大致相同的疏水性，虽然选择性可以是不同的，这要归于与蛋白质芳香基的兀-兀相互作用的可能性。高的盐浓度有利于蛋白质吸附至HIC柱，但是实际浓度可以在很大范围内变化，这取决于蛋白质的性质和所选择的具体HIC配体。通常使用大约l和4M之间的盐浓度。自HIC支持物洗脱，无论是分步的或者是梯度的形式，可以通过多种方式来实现，诸如a)通过改变盐浓度，b)通过改变溶剂的极性，或c)通过添加去污剂。通过降低盐浓度，吸附的蛋白质按照疏水性升高的次序洗脱下来。极性方面的改变可能受到添加溶剂诸如乙二醇或异丙醇的影响，这是因为降低了疏水相互作用的强度。去污剂发挥蛋白质的置换物的功能，而且已经主要用于膜蛋白的纯化。多种阴离子组分可附着于基质以形成用于层析的阳离子支持物。阴离子组分包括羧曱基、巯基(sulfethyl)、磺丙基、磷酸根和磺酸根(S)。纤维素离子交换树脂诸如SE52、SE53、SE92、CM32、CM52、CM92、Pll、DE23、DE32、DE52、EXPRESSIONS和EXPRESSIONC可从WhatmanLTD,MaidstoneKentU.K获得。还知道基于SEPHADEXTM和SEPHAROSETM的且交联的离子交换剂，产品名称是CMSEPHADEXC-25、CMSEPHADEXC画50和SPSEPHADEXTMC-25、SPSEPHADEXTMC-50~SP-SEPHAROSETMHighPerformance、SP-SEPHAROSETMFastFlow、SP-SEPHAROSEXL、CM-SEPHAROSETMFastFlow、及CM-SEPHAROSEtmCL-6B,都可以从GEHealthcare获得。用于实施本发明的离子交换剂的例子包括但不限于例如其商品名为MACROPREPTM的离子交换剂，诸如例如来自BioRad，Hercules,CA的MACROPREPS支持物、MACROPREPTMHighS支持物和MACROPREPCM支持物。自阳离子层析支持物的洗脱通常通过提高盐浓度来实现。因为自离子柱的洗脱牵涉添加盐，而且因为，如所述的，HIC在盐浓度中是增强的，所以任选在离子步骤或其它盐步骤之后引入HIC步骤。在本发明的一个实施方案中，阳离子交换层析步骤在HIC步骤之前。下文描述了用于纯化VEGF的方法的例子，例如参见实施例5和6。在重折叠之后，通过深部过滤除去集合中的不溶性材料。然后将澄清的集合加载到在5mMHEPPS/0.05%TRITONTMX100/pH8中平衡的陶瓷羟磷灰石柱(BioRad,Hercules,CA)上。通过用平衡緩沖液清洗来除去非结合性蛋白质，并使用50mMHEPPS/0.05%TRITONX100/0.15M磷酸钠/pH8的等度步骤来洗脱VEGF。将VEGF集合加载到在50mMHEPPS/0.05%TRITONTMX100/0.15M磷酸钠/pH8中平衡的丁基SEPHAROSEtmFastFlow柱(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)上。用平衡緩冲液清洗柱子，并在柱流出液中收集VEGF。将丁基SEPHAROSETM集合加载到在50mMHEPES/pH8中平衡的MacroPrepHighS柱(BioRad,Hercules,CA)上。在清洗至280nm流出液吸光度达到基线值之后，用两个柱体积的50mMHEPES/0.25M氯化钠/pH8清洗柱子。使用50mMHEPES/pH8中线性的、8个柱体积的0.25-0.75M氯化钠梯度洗脱VEGF。收集各级分，并合并那些包含正确折叠的VEGF的级分，其通过肝素结合测定法来确定。用等体积的50mMHEPES/0.8M柠檬酸钠/pH7.5调整(condition)MacroPrepHighS集合。然后将调整好的集合加载到用50mMHEPES/0.4M柠檬酸钠/pH7.5平衡的苯基5PWTSK柱(TosohBioscienceLLC,Montgomeryville,PA)上。用平衡緩冲液将非结合性蛋白质清洗流过柱子之后，使用50mMHEPESpH7.5中的、10个柱体积的0.4-0M柠檬酸钠梯度洗脱VEGF。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各级分，并合并那些包含足够纯度VEGF的级分。在宿主细胞中表达肝素结合蛋白简言之，将能够相对于宿主原核细胞基因组自主复制并表达蛋白质的表达载体导入宿主细胞。适宜表达载体的构建是本领域公知的，包括本文中所描述的肝素结合蛋白的核普酸序列。参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor,NewYork)(2001);Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocolsJohnWileyandSons(NewJersey)(2002);及，Banevx,(1999)CurrentOpinioninBiotechnology,10:411-421。适宜yf斗亥纟田月包(包括细菌)、表达载体可购自例如美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville，Maryland。用于大规;漠培养原核细胞(尤其是细菌细胞)培养物的方法是本领域公知的，这些方法可用于本发明的内容。例如，将原核宿主细胞用编码感兴趣肝素结合蛋白的表达载体或克隆载体转染，并在常规营养培养基中培养，该培养基酌情为诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因而进行改良。编码感兴趣多肽的核酸可以是任何来源的RNA、cDNA、或基因组DNA,只要它编码感兴趣多肽。选择用于在微生物宿主中表达异源多肽(包括其变体)的适宜核酸的方法是本领域公知的。通过本领域已知的多种方法制备编码多肽的核酸分子。例如，将编码VEGF的DNA分离并测序，例如通过利用能够特异性结合至编码VEGF的基因的寡核苷酸探针。将异源核酸(例如cDNA或基因组DNA)恰当的插入可复制载体，用于在合适启动子的控制下在微生物中表达。许多载体可用于此目的，而且适宜载体的选择将主要取决于将插入载体的核酸的大小及将用该载体转化的具体宿主细胞。每种载体包含各种构件，其取决于它与之相容的具体宿主细胞。取决于宿主的具体类型，载体构件通常包括但不限于以下一型或多型信号序列、复制起点、一个或多个标志基因、启动子、和转录终止序列。通常，与微生物宿主一起使用包含衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体。载体通常携带一个复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，一般用pBR322转化大肠杆菌，pBR322是衍生自大肠杆菌物种的质粒(参见例如Bolivaretal.(1977)Gene,2:95)。pBR322包含氨千青霉素和四环素抗性的基因，并如此提供鉴定转化细胞的容易方法。pBR322质粒或其它细菌质粒或噬菌体还通常包含或经修饰而包含能被宿主用于表达可选择标志基因的启动子。(i)信号序列本发明的多肽不仅可以直接地重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来生产，该异源多肽一般是信号序列或具有在成熟蛋白质或多肽的N-末端的特异性切割位点的其它多肽。一般选择受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的异源信号序列。对于那些不识别并加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞而言，该信号序列用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导的原核信号序列替代。(ii)复制起点构件表达载体包含使得支持物能够在一种或多种选出的宿主细胞中复制的核酸序列。多种微生物的此类序列是公知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌。(iii)选择基因构件表达载体通常包含选择基因，也称为可选择标志物。该基因编码在选拷:性w-养基中培养的经过转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中不会存活。这种可选择标志物与本发明所利用的和所定义的遗传标志物是不同的。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)其赋予针对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、曱氨喋呤、或四环素，(b)其补足不是由遗传标志物的存在而引起的营养缺陷，或(c)其提供不能从复合培养基中得到的关键营养素，例如用于芽胞杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用药物来阻抑宿主细胞的生长。在这种情况中,用感兴趣核酸成功转化的细胞生成赋予耐药性的多肽并如此从该选择方案中存活下来。这样的显性选择的例子使用药物新霉素(Southemetal.，(1982)LMolec.A。pl.Genet.,1:327)、霉酚酸(Mulliganetal.,(1980)Science,209:1422)或潮霉素(Sugdenetal.，(1985)Mol.Cell.Biol.,5:410413)。上文给出的这三个例子采用真核控制下的细菌基因来传送分别针对适宜药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)、或潮霉素的抗性。(iv)启动子构件用于生成感兴趣肝素结合蛋白的表达载体包含受到宿主生物体识别且与编码感兴趣多肽的核酸可操作连接的合适启动子。适用于原核宿主的启动子包括卩-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Changetal.，(1978)Nature,275:615;Goeddeletal.,(1979)Nature,281:544)、阿拉伯糖启动子系统(Guzmanetal.,(1992)J.Bacteriol.,174:7716-7728)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，(1980)NucleicAcidsRes.,8:4057及EP36，776)及杂合启动子诸如tac启动子(deBoeretal.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。它们的核苷酸序列已经公布，由此使得熟练工作人员能够使用接头或衔接头提供任何需要的限制性位点以将其可操作连接至编码感兴趣多肽的DNA(Siebenlistetal,(1980)￡^11，20:269)。还可参见例如Sambrooketal"同上。在细菌系统中使用的启动子通常还包含与编码感兴趣多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。可以通过限制酶消化从细菌来源DNA中切下启动子并将其插入包含所需DNA的载体。(v)载体的构建和分析使用标准连接技术构建包含一个或多个上文所列构件的合适载体。将分离的质粒或DNA片段切割，剪裁，并再连接成产生所需质粒需要的形式。为了分析以证实所构建质粒中的正确序列，使用连接混合物转化大肠杆菌K12菌抹294(ATCC31,446)或其它菌株，并通过适当的氨千青霉素或四环素抗性选择成功的转化子。从该转化子中制备质粒，并通过限制性内切核酸酶消化进行分析，和/或通过Sangeretal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467或Messingetal.,(1981)NucleicAcidsRes.,9:309的方法或者通过Maxametal.(1980)MethodsinEnzymology,65:499的方法测序。还可参见例如Sambrooketal.,同上;及Ausubeletal丄,同上。将编码感兴趣肝素结合蛋白的核酸插入宿主细胞。一般地，这是通过用上文所述表达载体转化该宿主细胞并在为了诱导各种启动子而酌情改良的常规营养培养基中培养而实现的。(vi)培养宿主细胞用于表达感兴趣肝素结合蛋白的合适原核细胞是本领域公知的。一般使用那些以包涵体形式或者在周质空间或胞内空间中大量表达重组蛋白的宿主细胞。合适的原核生物包括细菌，例如真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(Eco//)、芽胞杆菌属(^^7//)诸如枯草芽胞杆菌CS.w^-fc)、假单胞菌属CP化w(/owo"oy)物种诸如铜绿假单胞菌CP(3wwg7'Mcwfl)、鼠伤寒沙门氏菌(5""/mo"e〃a妙/n'附,'w—或粘质沙雷氏菌(&rratowarcMcms)。大肠杆菌宿主的一个例子是大肠杆菌294(ATCC31,446)。其它菌抹诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子是例示性的而不是限制性的。W3110菌抹是一种典型的宿主，因为它是用于重组DNA产品发酵的常用宿主菌抹。在本发明的一个方面，宿主细胞会分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以实现编码蛋白质的基因中一处遗传突变，这样的宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌抹1A2、27A7、27B4、和27C7，其记载于1995年4月25日公告的美国专利号5,410,026。例如，用于生产VEGF的一种菌抹是具有基因型to"y4zffifeg尸47〃vg的大肠杆菌菌抹W3110，称为49B3。在另一个例子中，用于生产VEGF的菌林是具有基因型4/7Wv4(Ato"々p/d,/ac/,/ac丄S，Aom;rAfw;C-/e;￡」Acfeg尸z7vG+的大肠杆菌菌抹(62A7)。还可参见例如WO2004/092393跨越页码23-24的表格。用于生产感兴趣肝素结合蛋白的原核细胞在本领域已知的且适于培养所选择的宿主细胞的培养基中进行培养，包括Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor,NewYork)(2001)中一般性描述的培养基。适合于细菌的培养基包括但不限于AP5培养基、营养肉汤、Luria-Bertani(LB)肉汤、Neidhardt氏极限培养基、和C.R.A.P.极限或完全培养基，加上必需的营养补充物。在某些实施方案中，培养基还包含选择剂，其根据表达载体的构造来选择，以选择性允许包含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨千青霉素添加至培养基以用于培养表达氨节青霉素抗性基因的细胞。还可以以适宜浓度包含在碳、氮、和无机磷酸盐源之外的任何必需补充物，或是独自引入或是作为与另一补充物或培养基的混合物诸如复合氮源。任选地，培养基可以包含一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸盐/酯、二碌u赤藓糖醇、和二好u苏糖醇。美国专利号5,304,472和5,342，763给出了合适培养基的例子。C.R.A.R磷酸盐限制培养基包含3.57g(NH4)2(S04)，0.71g二水合柠檬酸钠，1.07gKC1，5.36g酵母^是取物(经过鉴定的)，5.36gHycaseSFTM-She伍eld，用KOH调整pH至7.3,用去离子水调整适量体积至872毫升，并高压灭菌；冷却至55。C，并补充110ml1MMOPSpH7.3，llml50%葡萄糖，7ml1MMgS04。然后可以向诱导培养基添加羧千青霉素至50吗/ml的浓度。在合适的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌的培养，例如温度范围为例如大约20。C到大约39。C,或者大约25。C到大约37。C,或者大约30。C。若使用碱性磷酸酶启动子，则在合适培养基中培养用于生产本发明感兴趣多肽的大肠杆菌细胞，其中可以如例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor,NewYork)(2001)—般性描述的部分地或完全地诱导碱性磷酸酶启动子。培养不能缺乏无机磷酸盐或者处于磷酸盐饥饿水平。首先，培养基包含无枳^粦酸盐，其量高于诱导蛋白质合成且足以使细菌生长的水平。随着细胞生长并利用磷酸盐，它们降低了培养基中的磷酸盐水平，由此引起多肽合成的诱导。如果启动子是可诱导型启动子，那么为了让诱导发生，一般培养细胞直到达到某光密度，例如使用高细胞密度工序时大约200的A550,在这个点启动诱导(例如通过添加诱导物，通过耗尽培养基的一种成分等)，以诱导编码感兴趣多肽的基因的表达。还可以包含本领域技术人员知道的适宜浓度的任何必需补充物，或是独自引入或者作为与另一补充物或培养基诸如复合氮源的混合物。培养基的pH可以是大约5到9中的任何pH，这主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH是例如大约6.8到大约7.4，或者大约7.0。肝素结合蛋白的配制剂回收(例如使用本文中所描述的方法)的多肽可以在制药学可接受的载体中配制，并用于此类分子已知的各种诊断、治疗、或其它用途。例如，本文中所描述的VEGF可用于免疫测定法，诸如酶免疫测定法。还设想了^f吏用本文中所描述的方法获得的肝素结合蛋白的治疗用途。例如，生长因子或激素，例如VEGF，可用于根据需要增强生长。例如，VEGF可用于促进伤口愈合，例如急性伤口(例如烧伤、手术伤口、正常的伤口等)或慢性伤口(例如糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、褥疮(decubitusulcer)、静脉曲张性溃疡等)；促进毛发生长；促进组织生长和修复(例如骨、肝等)等。供贮存的肝素结合蛋白治疗用配制剂是如下制备的，混合具有所需的纯度的分子(例如多肽)与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences18thedition,Gennaro,A.Ed.(1995))，以冻干剂型或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括緩冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基双曱基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯曱酸烷基酯诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(小于约IO个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，用于体内施用的配制剂是无菌的。这易于通过无菌滤膜的过滤来实现。HBP可以冻干形式或者作为水溶液或凝胶形式来贮存。HBP制剂的pH可以是例如大约5到8,虽然在某些情况中更高或更低的pH值可能也是合适的。可以理解，使用某种赋形剂、载体、或稳定剂可以形成HBP的盐。一地用于伤口愈合时，HBP配制成用于位点特异性的递送。当表面地使用时，HBP适合同其它成分相结合，诸如载体和/或助剂。对于此类其它成分的性质没有限制，只是它们必须是制药学可接受的且对于它们的预定施用是有效的，而且不能显著降低配制剂的活性成分的活性。合适的媒介的例子包括软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、或悬浮液。有或者没有纯化的胶原。各成分也可以注入无菌敷料、透皮贴片、膏药、和绷带，任选液体或半液体的形式。为了获得凝胶配制剂，在液态组合物中配制的HBP可以与有效量的水溶性多糖或合成聚合物诸如聚乙二醇混合以形成具有适于表面应用的适当粘性的凝胶。可以使用的多糖包括例如纤维素衍生物诸如醚化纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、和烷基羟烷基纤维素，例如曱基纤维素、羟乙基纤维素、羧曱基纤维素、羟丙基曱基纤维素、和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉；琼脂；海藻酸和海藻酸盐/酯；阿拉伯树胶；pullullan;琼脂糖；角叉菜胶；右旋糖苷；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖；和合成生物聚合物；以及树胶，诸如黄胞胶；瓜尔胶；豆角胶(locustbeangum);阿拉伯树胶；黄蓍胶；和卡拉雅胶(karayagum);及其衍生物和混合物。在本发明的某些实施方案中，本文中的胶凝剂是例如对生物学系统惰性的、无毒的、易于制备的、和/或不太松软的或粘性的、以及不会使其中的HBP不稳定的一种胶凝剂。在某些实施方案中，多糖是醚化的纤维素衍生物，在另一个实施方案中，是明确定义的、纯化的、和美国药典中所列的，例如曱基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、和羟丙基曱基纤维素。在一个实施方案中，曱基纤维素就是多糖。如果在凝胶中采用曱基纤维素，例如，它一般占到凝胶的大约2-5%、或者大约3%、或者大约4%、或者大约5%,并且HBP的量是大约每ml凝胶300-1000mg。可用于凝胶的聚乙二醇一般是低和高分子量聚乙二醇的混合物以获得适当的粘性。例如，分子量400-600的一种聚乙二醇与分子量1500的一种聚的。''—'、"、、、'、'术语"水溶性的，，在应用于多糖和聚乙二醇时是指包括胶状溶液和分散体。通常，纤维素衍生物的可溶性由醚基团的取代程度决定，而且本文中有用的稳定衍生物应当在纤维素链的每一脱水葡萄糖单元上有足够数量的此类醚基团，以使得衍生物可溶于水。每个脱水葡萄糖单元中至少0.35个醚基团的醚取代程度通常是足够的。另夕卜，纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例如锂、钠、钾、或铯盐。活性成分还可以装在微胶嚢中或持续释放制剂中。参见例如,Remington'sPharnmceuticalSciences18thedition,Gennaro,A.Ed.(1995)。还可参见Johnsonetal.,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda，Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993);Horaetal.,Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland,"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"于VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,PowellandNewman,eds,(PlenumPress:NewYork,1995),pp.439-462;WO97/03692，WO96/40072,WO96/07399;美国专利号5,654,010;DE3,218,121;Epsteinetal.,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692;Hwangetal.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034;EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请83-118008;美国专利号4,485,045和4,544,545;以及EP102,324。以下实施例是作为例示而非作为限制提供的。实施例实施例l:大肠杆菌中表达的重组人类VEGF在大肠杆菌中表达重组人类VEGF。在合成过程中，蛋白质分泌进入周质空间，并积聚成折射体。为此实施研究以实现蛋白质的抽提和重折叠。这些研究揭示了使用标准回收技术且不添加聚阴离子试剂时分离出了至少3种VEGF(图1)。对于天然VEGF的研究显示了添加肝素提高了对离液剂和硫醇诱导的变性的抗性(图2)。另外，在小规模重折叠实验中，肝素显著增加了正确重折叠的VEGF的量。为了调整该结果以适应大规j模工艺，找到了容许在硫酸右旋糖苷(作为肝素结构类似物的分子)存在时VEGF重折叠的条件。相对于对照而言，添加碌u酸右旋糖苷使正确折叠的、有生物学活性的VEGF的产量增加了3-5倍。方法用于VEGF^表达的质粒——质粒pVEGF171设计用于在大肠杆菌周质中表达人类VEGF!65(参见例如Leungetal.，(1989)Science,246:1306-1309)。VEGF编码序列的转录位于碱性磷酸酶(AP)启动子的紧密控制之下(参见例^口Kikuchietal.,(1981)NucleicAcidsResearch,9:5671-8)，同时由tipShine-Dalgamo区提供翻译起始所需要的序歹。(参见例如Yanofskyetal.，(1981)NucleicAcidsResearch,9:6647-68)。VEGF编码序列融合在细菌热稳定的肠毒素II(STII)信号序列的下游(参见例如Leeetal.,(1983)Infect.Immun.,42:264-8;及Pickenetal"(1983)Infect.Immun.,42:269-75)以便随后分泌进入大肠杆菌周质。STII信号序列中的密码子修饰提供了受到调整的翻译水平，这在周质中产生最佳的VEGF积累水平(参见例如SimmonsandYansura,(1996)NatureBiotechnoloy,14:629-34)。、。转录终止子(参见例如ScholtissekandGrosse,(1987)NucleicAcidsResearch,15:3185)位于VEGF转录终止密码子的下游。复制起点、及氨苄青霉素和四环素抗性基因由质粒pBR322提供的。参见例如Bolivaretal.(1977)Gene,2:95-113。细胞匀浆和折射体制备一一收获的大肠杆菌细胞冻存于-70。C。细胞使用BTUX(离心机，Alfalaval)离心收获，并使用BEPEX(大规模冷冻机)(5L/kg沉淀物)，并在15M型实验室均质器Gaulinl5M(小规模)或M3(大规模)(GaulinCorporation,Everett,MA)中匀浆。然后用等体积的同样緩冲液稀释细胞悬浮液，并在BTPX205(AlfaLavalSeparationAB，Tumba,Sweden)连续进料离心机中通过离心收获折射体。中等规模离心机使用SA1。另外，可以将细胞匀浆，并可以直接收获沉淀物而不在BEPEX中冷冻和再水化。实施例2:在大肠杆菌中表达的重组人类VEGF的抽提和重折叠-I方法抽提和重折叠——将折射沉淀物悬浮于含7M尿素/50mMHEPPS/pH8(终浓度)的抽提緩沖液，用量5L緩沖液/kg沉淀物。然后按3.7g/kg沉淀物添加固体二硫苏糖醇，达到4mM的终浓度。参见例如图9，其显示了尿素和DTT对VEGF抽提的影响。将悬浮液于20。C彻底混合l-2小时。可以用50%氢氧化钠(w/w)调整pH至pH8.0。通过每一体积抽提緩沖液添加19体积重折叠緩冲液来启动重折叠。重折叠緩冲液含50mMHEPPS/lM-2M尿素/2-5mM半胱氨酸/0.05%-0.2%TRITONX100/pH8(终浓度)。参见例如图IO,其显示了重折叠过程中存在的尿素和DTT浓度的影响。如所示的添加硫酸右旋糖苷、肝素或硫酸钠。于室温实施重折叠温育4-24小时。任选地，可以于室温实施温育长达大约48小时。折叠通过SDS-PAGE和/或肝素HPLC来监测。通过使用Cuno90SP滤器继之以0.45(im滤器的深部过滤来澄清产品。肝素结合HPLC测定法一一使用包含固定化肝素的柱子测定正确重折叠的VEGF的质量和lt量。POROSHE2/M柱(4.6x100mm，HE2/M购自PerSeptiveBioResearchProducts,Cambridge,MA)在含0.15MlU匕钠的10mM磷酸钠pH7中平衡。以lml/min或2ml/min的流速，使用10分钟的、平衡緩沖液中的0.15M到2M的氯化钠线性梯度洗脱该柱。在有些测定法中，洗脱进行16分钟。在280nm处监测洗提液。一般地，大部分蛋白质在外水体积中洗脱，并且可以鉴定出3种VEGF。最高亲和力、最迟洗脱的种类鉴定为正确折叠的VEGF,后来鉴定为"峰3VEGF"。结果肝素保护VEGF抵抗半胱氨酸介导的变性然VEGF导致正确折叠的分子大大减少(图2)。种不同形式的肝素，防止了该变性作用。表Ia肝素和石克酸右旋糖芬对VEGF重折叠的影响添加浓度(照/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表中的数值是每克折射沉淀物形成的峰3VEGF的量(单位为毫克)。每次添加的浓度如所示的。*平均对照(5.6+5.0=5.3)表Ib<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表中的数值是每克折射沉淀物形成的峰3VEGF的量(单位为毫克)。每次添加的浓度如所示的。——添加10mM半胱氨酸至天通过添加浓度〗氐到20mM的2肝素和硫酸右旋糖普对VEGF重折叠的影响添加浓度(Hg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表中的数值是每克折射沉淀物形成的峰3VEGF的量(单位为毫克)。总结肝素和硫酸右旋糖苷提高重折叠产量一一由于如上所述针对变性的保护性特性，调查了数种不同形式的硫酸化聚合物对重折叠VEGF的影响。如表la(和图5)所示，肝素的低分子量和高分子量形式都使重折叠VEGF的产量提高了大约3倍。如表Ib(和图6)所示，硫酸钠使重折叠VEGF的产量提高了大约2倍。10Kd形式的硫酸右旋糖苦也有效的提高了重折叠产量；然而，所调查的较高的浓度范围导致底物抑制。进一步的调查证明了5Kd、8Kd和10Kd形式的硫酸右旋糖苷都显著提高了重折叠VEGF的产量(表II)。见图7。还可见图8。实施例3:不同緩沖液和TRITONtmX-100对VEGF回收的影响结果緩沖液VEGF(mg/g沉淀物)HEPES，pH8HEPES,pH8，含TRITONtmHEPPS,pH8TrisHCl，pH8緩沖液13.314.316.612.8VEGF(mg/g沉淀物)HEPES,pH7.2HEPPS,pH7,29.110.7HEPES，pH8HEPPS,pH810.312.8HEPES,pH8+TRITONTMX-100HEPPS,pH8+TRITONX-10012.413.9总结实施例1、2和3的数据结合起来证明了通过在重折叠VEGF(—种肝素结合生长因子)时包括硫酸肝素或硫酸右旋糖苷以及回收的条件实现了产量的显著(2-5倍)改善。这种方法已经在工业规模成功实施。预期这种方法可应用于其它碱性生长因子和其它结合肝素的蛋白质的重折叠。实施例4:在大肠杆菌中表达的重组人类VEGF的抽提和重折叠-II方法抽提和重折叠一一将折射沉淀物悬浮于抽提緩沖液，其中终浓度为7M尿素、2-30mMDTT(例如10mMDTT)、50mMHEPPS/pH7-9(例如pH8)，用量5L緩冲液/kg沉淀物。将悬浮液于室温彻底混合l-2小时。通过每一体积抽提緩冲液添加19体积重折叠緩冲液来启动重折叠。重折叠緩冲液含1M或1.3M尿素、2-15mM半胱氨酸(例如7.5mM半胱氨酸)、0.5mMDTT、0-0.75M精氨酸(例如100mM精氨酸)、15mg/L硫酸右旋糖苷、50mMHEPPS、0.05%TRITONtmX100/pH8(终浓度)。参见例如图12,其显示了在存在带电荷氨基酸时对重折叠的影响，其中添加组氨酸产生与没有氨基酸添加物时相同的效果。于室温实施重折叠温育12-24小时。任选地，可以于室温实施温育长达大约48小时。任选地，在重折叠工艺过程中可以添加空气或氧气(0.3-lcc/min/L)。折叠通过SDS-PAGE和/或肝素HPLC来监测。通过使用Cuno90SP滤器继之以0.45pm滤器的深部过滤来澄清产品。抽提和重折叠步骤的总体稀释度是1:100。提高抽提和重折叠步骤的总体稀释度(例如提高到1:100至1:200)增加了活性VEGF的总量，虽然浓度是降低的。参见图13。通过测定二聚体/单体的量，可以测定重折叠的效率，其中可以通过C18反相HPLC柱来测定单体，可以通过肝素柱层析或SP-5PW阳离子交换层析测定法来测定二聚体形成。实施例5:大,重折叠为了检验最佳化重折叠条件的可缩放性(scalability)，实施研究以检验在小的(O.IL)、中等的(1L)和试验工厂(pilotplant)(250L到400L)规模的重折叠动力学。如图4所示，大规模的重折叠动力学和较小规模的是难以区分的，而且重折叠VEGF的最终滴度是略微增加的。这些数据证明了利用硫酸右旋糖苦的重折叠的可缩放性。通过使用Cuno90SP滤器继之以0.45pm滤器的深部过滤来进一步澄清产品。实施例6:重折叠之后rhVEGF的纯化IMacroPrep陶瓷羟磷灰石层析——重折叠之后，通过深部过滤除去集合中的不溶性物质。然后将澄清后的集合加载到在50mMHEPPS/0.05%TRITONX100/pH8中平衡的陶瓷羟磷灰石柱(35Dx31H=30L)(BioRad，Hercules,CA)上。通过用平衡緩冲液清洗来除去不结合性蛋白质，并使用50mMHEPPS/0.05%TRITONX100/0.15M磷酸钠/pH8的等度步骤洗脱VEGF。流速是120cm/hr。通过各级分的肝素HPLC分析来确定合并的的级分。丁基SEPHAROSEtmFastFlow层析——将VEGF集合加载到在50mMHEPPS/0.05%TRITONX100/0.15M磷酸钠/pH8中平#f的丁基SEPHAROSEFastFlow柱(35Dx26H=25L)(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)上。流速是100cm/hr。用平衡緩冲液清洗该柱，并在柱洗提液中收集VEGF。收集各级分，并合并含蛋白质的级分，这通过A280nm来测量。MacroPrepHighS层析——将丁基SEPHAROSETM集合加载到在50mMHEPES/pH8中平衡的MacroPrepHighS柱(30Dx39H=27L)(BioRad，Hercules,CA)上。清洗至洗提液在280nm处的吸光度达到基线值后，用两个柱体积的50mMHEPES/0.25M氯化钠/pH8清洗该柱。使用50mMHEPES/pH8中的、8个柱体积的0.25-0.75M氯化钠线性梯度洗脱VEGF。流速是75-200cm/hr。收集各级分，并合并通过肝素结合测定法例如肝素HPLC确定为含正确折叠VEGF的级分。苯基5PWTSK层析——将MacroPrepHighS集合用等体积的50mMHEPES/0.8M柠檬酸钠/pH7.5调节。然后将调节好的集合加载到在50mMHEPES/0.4M柠檬酸钠/pH7.5中平衡的苯基5PWTSK柱(18Dx43H=11L)(Tosohaas,Montgomeryville，PA)上。用平衡緩冲液清洗不结合性蛋白质通过该柱之后，用50mMHEPES/pH7.5中的、10个柱体积的0.4-0M柠檬酸钠梯度从该柱洗脱VEGF。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各级分，并包含包含足够纯度VEGF的级分。超滤/透滤——将合并的VEGF在5kD再生纤维素膜(G30619);UnitPellicon;FeedRate17.1L/min上超滤。用聚山梨醇酯20调节该膜。在6g/L(UF1)的浓度超滤该合并的VEGF。将样品用7-14DV(Diavolume)在5mM琥珀酸钠/275mM海藻糖/pH5.0中渗滤。最终的配制剂是5mM琥珀酸钠/275mM海藻糖/0.01。/。聚山梨醇酯20/ph5.0，浓度为5mg/ml。实施例7:重折叠之后rhVEGF的纯化II阳离子交换液相层析一一重折叠之后，通过深部过滤除去集合中的不溶性物质。将该重折叠集合调节至pH5.0-7.5和大约2-6.5mS/cm。在一个实施方案中，将该集合调节至pH6.5和5mS毫秒/cm。然后可以将该重折叠集合加载到磺丙基极端负载柱(sulfopropylextremeloadcolumn,SPXL)上，并使用盐浓度渐增的梯度洗脱。可以通过各级分的肝素HPLC分析来确定合并的级分。疏水相互作用柱(HIC)——可以将VEGF的SPXL洗脱集合调节至50mS/cm以便加载到苯基TSK层析柱(Tosohaas,Montgomeryville，PA)上。收集级分，并合并含蛋白质的级分。IEX或混合模式一一可以将苯基TSK集合加载到离子交换层析(IEX)柱或混合模式层折柱上。收集级分，并合并通过本文所述测定法确定为包含正确折叠VEGF的级分。超滤作用/透滤法——将合并的VEGF在5kD再生纤维素膜(G30619);UnitPellicon;FeedRate17.1L/min上超滤。例如，用聚山梨醇酯20调节该膜。在6g/L(UF1)的浓度超滤该合并的VEGF。将样品用7-14DV(Diavolume)在5mM琥珀酸钠/275mM海藻糖/pH5.0中渗滤。本文所述方法和工艺中，最终的纯度和/或活性可以通过以下方法来评估肽作图、二硫化物作图、SDS-PAGE(还原性的和非还原性的)、圓二色性、鲎变形细胞溶解物(LAL)、肝素层析、肝素HPLC(例如，肝素HPLC可用于测定VEGF二聚体浓度)、反相(rp)HPLC(例如，rpHPLC可用于测定VEGF单体浓度)、肝素结合、受体结合(例如对于VEGF，例如KDR受体结合-BioanalyticR&D，和/或Fltl受体结合)、SEC分析、细胞测定法、HUVEC效能测定法、利用VEGF抗体的ELISA、质谱分析等。应当理解，本文所述保藏、实施例和实施方案仅仅是用于例示目的，根据本文得到的多种修饰或改变对于本领域技术人员是暗含在内的，它们也包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文中所引用的所有出版物、引用、专利、和专利申请都完整收录在此作为参考，用于所有目的。权利要求1.一种用于从原核细胞培养物中回收肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤(a)从所述原核细胞培养物的周质中分离所述肝素结合蛋白；(b)在包含离液剂和还原剂的第一缓冲溶液中变性所述分离的肝素结合蛋白；(c)在包含离液剂和硫酸化聚阴离子试剂的第二缓冲溶液中温育所述变性的肝素结合蛋白，温育的时间和条件使得肝素结合蛋白发生重折叠；和(d)回收所述重折叠的肝素结合蛋白，其中与没有硫酸化聚阴离子试剂的温育相比回收的重折叠的肝素结合蛋白有大约2到5倍的增加。16.权利要求15的方法，其中所述第一和第二疏水相互作用层析支持物选自丁基-、丙基、辛基-、和芳基-琼脂糖树脂。17.权利要求15的方法，其中所述第一疏水相互作用层析支持物是丁基-琼脂糖支持物而所述第二疏水相互作用层析支持物是苯基-琼脂糖支持物树脂。18.权利要求l的方法，其中所述回收步骤(d)包含使所述重折叠的肝素结合蛋白顺序接触阳离子交换支持物、疏水相互作用层析支持物、和离子交换层析支持物，并从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。19.一种用于从原核细胞培养物中回收肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤(a)从所述原核细胞培养物的周质中分离所述肝素结合蛋白；(b)在包含离液剂和还原剂的第一緩沖溶液中变性所述分离的肝素结合蛋白；(c)在包含离液剂和硫酸化聚阴离子试剂的第二緩沖溶液中温育所述变性的肝素结合蛋白，温育的时间和条件使得肝素结合蛋白发生重折叠，其中与没有硫酸化聚阴离子试剂的温育相比回收的重折叠的肝素结合蛋白有大约2到5倍的增加；和(d)使所述重折叠的肝素结合蛋白顺序接触羟磷灰石层析支持物、第一疏水相互作用层析支持物、阳离子层析支持物、和第二疏水相互作用层析支持物，并从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。20.—种用于纯化肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤使重折叠的肝素结合蛋白顺序接触羟磷灰石层析支持物、第一疏水相互作用层析支持物、阳离子层析支持物、和第二疏水相互作用层析支持物，并从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。21.—种用于从原核细胞培养物中回收肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤(a)从所述原核细胞培养物的周质中分离所述肝素结合蛋白；(b)在包含离液剂和还原剂的第一緩冲溶液中变性所述分离的肝素结合蛋白；(c)在包含离液剂和硫酸化聚阴离子试剂的第二緩沖溶液中温育所述变性的肝素结合蛋白，温育的时间和条件使得肝素结合蛋白发生重折叠，其中与没有硫酸化聚阴离子试剂的温育相比回收的重折叠的肝素结合蛋白有大约2到3倍的增加；和(d)使所述重折叠的肝素结合蛋白顺序接触阳离子交换支持物、疏水相互作用层析支持物、和离子交换层析支持物，并从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。22.权利要求19或21的方法，其中所述聚阴离子试剂在大约3,000道尔顿和10，000道尔顿之间。23.—种用于纯化肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤4吏重折叠的肝素结合蛋白顺序接触阳离子交换支持物、疏水相互作用层析支持物、和离子交换层析支持物，并从每个支持物上选择性洗脱肝素结合蛋白。全文摘要一种用于回收并纯化在异源宿主细胞中生产的、重折叠的肝素结合蛋白的方法包括将该溶解的蛋白质与聚阴离子诸如硫酸右旋糖苷一起温育的步骤。文档编号C07K14/435GK101336252SQ200680052416公开日2008年12月31日申请日期2006年12月19日优先权日2005年12月22日发明者戴维·W·卡恩,杰弗里·L·克莱兰,查尔斯·H·施梅尔泽,玛乔丽·E·温克勒,米歇尔·D·巴特勒,谢利·皮扎罗申请人:健泰科生物技术公司