专利名称：纤维连接蛋白n-端和c-端肝素结合域多肽在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维连接蛋白N-端和C-端肝素结合域多肽在制备抗肝癌细胞的药物中应用。
背景技术：
FN是已知的多功能糖蛋白，具有多个与其它分子结合的位点，包括N末端和C端肝素结合结构域。在获得高纯度FN的N端和C端肝素结合结构域多肽(分别简称rhFNHN^和 rhFNHC36)的基础上，我们研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽对人高转移肝癌细胞(MHCC97H) 粘附和侵袭功能的影响，并进一步分析其分子机制。侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特性。癌细胞的转移需要特殊的细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的相互作用。这些相互作用受整合素、钙粘合素和选择素的调节。 其中整合素调节癌细胞粘附到细胞外基质和细胞表面成份是关键的因素。因此，阻止癌细胞粘附至细胞外基质蛋白是治疗恶性肿瘤侵袭和转移的重要目标。纤维连接蛋白(简称FN)是有粘附作用的一种糖蛋白分子。前期的体外研究显示 FN锚定EMC在癌细胞的趋化性上发挥重要的作用。另一方面，对癌细胞的FN表达研究发现癌细胞FN的表达下降与癌细胞的生长和转移密切相关。这些可解释癌细胞FN表达的增加， 可相反地有效降低癌细胞的转移，这暗示着FN在抗癌细胞转移中的应用价值。我们的体外干预实验显示游离FN可抑制肝癌细胞的粘附和转移。暴露的FN细胞结合位点，处在游离与锚定状态之间则无此作用。游离FN与癌细胞表面分子(整合素)相互作用增加同种细胞的粘度。因此，我们相信游离FN有抑制肝癌细胞转移的作用。然而，FN的应用面临着许多的问题，如血资源的缺乏、血源性传染病的传播、其分子量达到420KD，利用基因工程技术全分子表达，目前还存在着难度。FN分子上有多个与锚定相关的活性位点，肝素结合区、胶原结合区、纤维蛋白结合区和细胞结合区。这些结合区域与多种细胞功能相关，包括粘附、 迁移、分化、细胞凋亡、形态改变，止血及修复损坏等等。因此，用FN多肽的功能区域来替代 FN是一个更可行的方法。对癌症治疗，有些报道显示了这样的作用。例如，FN中的RGD片段，包含粘附识别信号Arg-Gly-Asp，可抑制鼠肝细胞癌(HCC)肝内转移。CH50多肽，包含细胞I和肝素I双结合区域片段，能起到抑制肿瘤生长、侵袭和血管生成。FNIII14多肽也能有效抑制淋巴瘤细胞粘附和转移。肝素结合域是FN分子中的重要结构。一个Q37AA) 位于它的N-端，包含5个I型同源结构，另一个(272)位于C端，包含三个III型同源结构。我们曾利用遗传工程合成了重组N-端和C-端肝素结合域多肽(分别简称rhFNHN^* rhFNHC36)(其具体结构和蛋白序列见专利公开文献CN200810071172. 2)、并进一步证实其具有结合肝素的活性。然而，这些多肽对肿瘤的治疗作用仍未见报道。我们研究了 rhFNHN^ 和rhFNHC36多肽对人高转移性肝癌细胞(MHCC97H)的粘附和侵袭性的作用，并分析这种现象的潜在分子机制。
发明内容
针对以上现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种纤维连接蛋白N-端和 C-端肝素结合域多肽在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。本发明的目的是这样实现的，所述的二种重组纤维连接蛋白N端(又可写成 N-端)和C端(C-端)肝素结合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46-GlW82的237个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到 11 l!3bp，长71 lbp，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp ；由酵母表达的多肽分子量 *^.52kDa，纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽(简称rhFNHN-四)。所述的另一种重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，其特征在于是由FN分子中的IH-12、111-13、111-14三个III型同源结构组成，含有从Tyrl720-Tyrl991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从M^bp到6244bp，长816bp，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，由酵母表达的多肽分子量为36. 09kDa,纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽(简称rhFNHC_36)。所述的 rhFNHN-29和rhFNHC-36详细内容见本申请人先前申请的专利申请号为CN200810071172.2 的公开文献。本发明所述的rhFNHN-四和rhFNHC-36在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中的应用。为实现本发明的目的所采用的方法是1)采用结晶紫染色法检测不同浓度 rhFNHN29和rhFNHC36对MHCC97H细胞粘附FN的影响，Matrigel试验和裸鼠肺转移模型分别检测Matrigel对MHCC97H细胞侵袭力的影响。2)采用^festern blotting检测整合素和FAK磷酸化蛋白的表达、胶酶谱分析基质金属蛋白酶(MMPs)活性以及EMSA法检测活化蛋白-1 (AP-I)的活性。实验结果为rhFNH^9和rhFNHC36均能抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭能力，rhFNHC36需要的浓度更低。这种抑制效应是整合素α νβ 3介导的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制剂解除。rhFNHN29和rhFNHC36可以促进FAK酪氨酸磷酸化和AP-I的活性，从而降低整合素α ν，β 3和β 1的表达以及ΜΜΡ-9的活性。实验结论为rhFNH^9和 rhFNHC36在抗肝癌侵袭转移的治疗中具有潜在的应用前景。本发明的有益效果是通过大量的试验，本发明所述的rhFNH拟9和rhFNHC36均能抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭能力，而且抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭能力所需的 rhFNHC36浓度更低。这种抑制效应是整合素α ν β 3介导的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制剂解除。rhFNHN^和rhFNHC36可以促进FAK酪氨酸磷酸化和AP-I的活性，从而降低整合素 α ν，β 3和β 1的表达以及ΜΜΡ-9的活性。由此可见rhFNHN^和rhFNHC36能作为制备抗肝癌侵袭转移的药物应用，其治疗肝癌细胞侵袭转移具有潜在的良好的应用前景。
图1为本发明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽表达图。图中(A)部分是FN结构。FN是由一系列结构相同的的同源序列组成(FNI，FNII 和FNIII)。长方形代表I型结构，菱形代表II型结构，椭圆形物代表III型结构。rhFNHN29 包含N-端肝素结合区域(HBD)，是由五个I型结构组成。rhFNHC36包含C-端肝素结合区域，是由第12至14个三个III型结构组成。图中(B)部分，纯化rhFNHN^和rhFNHC36多肽经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮
兰染色。
图中(C)部分，纯化 rhFNHN29 和 rhFNHC36 多肽经 Western blotting 显示 FN 抗原性。图2A为本发明的人肝癌细胞系不同整合素或基质金属蛋白酶(MMPs)表达的 RT-PCR分析图。其中从肝癌细胞系中提取总RNA，反转录，PCR扩增整合素α 4，α 5，α V， β land β 3，β-actin 为内参。细胞系包括SMMC7721，BEL7404，H印G2，Huh_7，MHCC97L 和 MHCC97H ；图2B为本发明的人肝癌细胞系不同整合素或基质金属蛋白酶(MMPs)表达的 RT-PCR分析图。其中从肝癌细胞系中提取总RNA，反转录，PCR扩增MMP1，MMP2 and MMP9, β -actin 为内参。细胞系包括SMMC7721，BEL7404, HepG2, Huh-7, MHCC97L 和 MHCC97H ；图3A为本发明的rhFNH^9*rhFNHC36多肽抑制MHCC97H趋向和粘附FN，分别用 25 μ g/ml IgG, α ν 免疫球蛋白(P2W7)，β 3 (BV4)或 β 1 (8Α2)预处理的含 Mn2+ 的 MHCC97H 细胞接种于96孔板，孔板以FN(20 μ g/ml).或多聚赖氨酸00/毫升)封闭的条件下，测得的吸收分布图。图3B为本发明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽抑制MHCC97H趋向和粘附FN，在显微镜下比较在正常下的MHCC97H细胞形态和参照实验下的MHCC97H细胞形态、在有FN， rhFNHN29和rhFNHC36 (200 μ g/ml)存在下MHCC97H细胞中出现成纤维细胞状态图。图4为本发明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽对肿瘤转移克隆的影响图。图中在正常条件、FN, rhFNHN29和rhFNHC36多肽干预下6周龄裸鼠肺转移照片图。图5A为本发明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽按剂量依赖方式影响整合素α ν, β 3and β 1的表达图；图5Β为本发明的I hFNHC36和IihFNHN^多肽降低整合素表达和MMPs活性，在不同浓度rhFNHN^和rhFNHC36多肽中的MHCC97H细胞上清液的明胶酶谱图。 图6A为本发明的rhFNHN29和rhFNHC36多肽对FAK酪氨酸磷酸化和AP-I活性的影响图；具体ΡΑ0对rhFNH^9*rhFNHC36多肽抗粘附作用的影响。含和不含Mn2+(0. ImM) 的MHCC97H悬液，含和不含PAO (20 μ Μ)的MHCC97H悬液，分别先用FN，rhFNHN29 and rhFNHC36 (200 μ g/ml)处理，然后接种于有和没有FN封闭的96孔板中，观察MHCC97H对FN 的粘附。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明实验方法试剂、细胞培养和动物限制性酶 EcoRI，XhoI, BamHI, HindIII, BglII 和 T4 连接(来自 Promega 有限公司)，载体pGEM-T, pPIC9K, pAo815SM和GS115酵母细胞(来自Invitrogen公司)；纯化 S-100柱，SP柱和HiTrap Heparin HP柱(来自GE公司)。BSA、I型胶原蛋白、IV胶原蛋白及FN(来自 Sigma公司)。Anti-FN pAb, anti-integrin α v (P2W7), β 3 (BV4), β l(8A2)mAb and anti-p-FAK mAb were purchased from(来自 Santa Cluz 公司)。肝癌细胞(MHCC97L和MHCC97H)(来自上海复旦大学肝癌研究所)。雄性BALB/c裸鼠年龄在5到6周(来自中国科学院)。RhFNHN29 和 RhFNHC36 多肽的制备根据酵母表达载体特点确定N-端和C-端肝素结合域的克隆位点，并设计PCR引物和限制性内切酶5’-ATGCTC I TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTA-3’(rhFNHN29 -F)5， -ACGTAG 丨 AATTCTCCGCTCGATGTGGTCTGCA-3’ (rhFNHN29-R)5， -CGG I GATCCGCTATTCCTGCACCAACTGAC-3‘ (rhFNHC36-F)5， -CCCA I AGCTTCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3， (rhFNHC36-R)分别含XhoI/EcoRI and BamHI/Hindlll 内切酶。rhFNHN29基因克隆至T载体，筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择，再构建重组酵母表达PPIC9K载体，线性化重组载体并转染GSl 15酵母细胞，在GSl 15酵母细胞表达目的多肽。发酵液经80 %硫酸胺沉淀，沉淀物过S-100柱分离纯化，纯化物再经过 SP柱纯化。HPLC监测所收集纯化样本的UV280峰值，收集UV280峰值样本，SDS-PAGE电泳， western blotting检测FN抗原性，质谱仪测量其分子量。rhFNHC36多肽的制备过程同rhFNHN^多肽的的制备。详细内容请见专利申请号为CN200810071172. 2的公开文献报道。半定量RT-PCR分析用Trizol从细胞系中分离RNA，并反转录。用PCR方法扩增整合素α 4 096bp)， α 5(362bp), α v(236bp), β 1(407bp)禾口 β 3(327bp)， ΜΜΡ-1(428bp)， ΜΜΡ-2(390bp)， MMP-9(215bp)和 β-actin (500bp)等的 cDNA 片段。PCR 扩增引物如下整合素α 4 上 5，-CAACACGCTGTTCGGCTAC-3，下5， -TATGCCCACAAGTCACGATG-3，；整合素α 5 上 5，-CCGAATTCTGGAGTATGCAC-3，下5， -TGGTGACATAGCCGTAAGTG-3，；整合素α ν 上 5，-GGAGCAATTCGACGAGCACT-3，下5， -GCAGGCGTGAACTGGTTAAG-3，；整合素β 1 上 5，-TGAAGGGCGTGTTGGTAGAC-3，下5， -GCCCTTGAAACTTCGGATCT-3，整合素β 3 ；上 5，-CACCAGTAACCTGCGGATTG-3，下5， -GTCTTGGCATCAGTGGTAAAC-3，；MMP-1 上 5，-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3，下5， -AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3，ΜΜΡ-2 上 5， -GCGACAAGAAGTATGGCTTC-3，下5， -TGCCAAGGTCAATGTCAGGA-3，；ΜΜΡ-9 上 5，-AGTTCCCGGAGTGAGTTGAA-3，下5， -CTCCACTCCTCCCTTTCCTC-3，；β -actin 上 5，-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3，
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下5， -GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3，细胞粘附实验用BSA, I型胶原蛋白，IV型胶原蛋白或FN(20 μ g/ml) ·封闭96孔板，将MHCC97H 细胞悬液OX 105/100 μ 1)加于96孔板中，细胞悬液分为含Mn2+和不含Mn2+。含Mn2+的 MHCC97H又分为含25μ g/ml IgG和不含25 μ g/ml IgG，以及含α v免疫球蛋白(P2W7)， β 3 (BV4)或β 1 (8Α2)。然后接种于96孔板，孔板以FN (20 μ g/ml) ·或多聚赖氨酸(20/毫升).封闭。含FN、rhFNH^9和rhFNHC36或不含的。37°C孵化1小时，PBS冲洗，细胞粘附到基底用结晶紫染色。测定590nm的吸光率。Matrigel 入侵检测8-mm孔径的PET膜先以20yg Matrigel预封膜，在转移小室中培养后转移至另一 M孔板中。底部用FN(0. 5毫克/毫升)封，空气干澡。包含Mn2+和不包含Mn2+的 MHCC97H 细胞(5X104/100 μ 1)的悬液，含和不含 FN、rhFNHN29 和 rhFNHC36,对照 IgG，或含抗α V(P2W7)，i3 3(BV4)或β 1 (8A2)免疫球蛋白。37°C孵化1小时，然后转移到上室中。 4 孵化后，插入膜在固定液中(含95%乙醇和5%的乙酸)固定30分钟。膜上面未侵入的细胞用棉花棒擦去。膜下面的细胞用HE染色，在倒置显微镜下X 100计数并算平均值。肺转移实验IXlO7的MHCC97H细胞溶于0.2毫升生理盐水中，接种于裸鼠的右侧。32只接种癌细胞的裸鼠随机分为四组(n = 8)，在接种癌细胞处分别注射PBS溶液、FN、rhFNHN29和 rhFNHC36，连续7天。6周后处死全部裸鼠，取肺组织，福尔马林固定、石蜡包埋，切片，HE染色。计算肺组织中的转移灶。MMPs 活性MHCC97H细胞(1. 2 X IO6)悬液接种于6孔板中，DMEM培养基中含10% FBS、Mn2+， 含与不含各种浓度的rhFNH^9和rhFNHC36。M小时后，细胞在无血清DMEM培养基培养 M小时。离心收集上清液，细胞用胰蛋白酶消化，评估实验结果。MMf3S活性测定实验，根据 Iwai报道的明胶酶谱分析法进行。20μ 1的上清液加到酶电泳分布图胶，辅以0. 明胶以检测ΜΜΡ-2和MMP-9。120V电压电泳90分钟。电泳后的胶用复性液冲洗，在孵化缓冲液中37°C 24小时，考马斯亮兰R-250染色。脱色液脱色。Westernblot整合素蛋白分析按MMI3S活性测定的实验方法培养MHCC97H细胞。50 μ g细胞提取物在10 % SDS-PAGE胶中电泳，电转膜至NC膜上，先结合抗整合素α ν，β 3和β 1抗体，再与HRP标记的抗鼠IgG杂交，用ECL检测。蛋白质酪氨酸磷酸化作用MHCC97H细胞在无血清DMEM培养基中孵育10小时，然后在含与不含氧化砷(ΡΑ0， 20 μ Μ)的DMEM培养基中5分钟，再在DMEM培养基中含Mn2+(0. ImM)，及含有与不含有FN， rhFNHN29 and rhFNHC36 QOO μ g/ml) 37°C 20分钟。提取细胞核蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白， 10% SDS-PAGE胶电泳，电转膜至PVDF膜上，先结合抗p-FAK (Tyr 397)抗体，再与HRP标记的抗鼠IgG杂交显色，用ECL检测。Band-shift 电泳检测(EMSA)按蛋白质酪氨酸磷酸化作用的方法培养MHCC97H细胞。根据EMSA说明，7 μ g细胞核蛋白提取物，与生物素标记的 AP-I 探针(5，-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3，/3，-GCGAACTAC TGAGTCGGCCTT-5，)在结合缓冲液中结合，室温20分钟。活化的AP-I在6. 5% SDS-PAGE电泳，转至尼龙膜上显色。
结果 RhFNHC36和RhFNHN^多肽的肝素亲和纯化FN-N端肝素结合域多肽是由五个相同的I型结构组成(图1中的A部分)，包含 237 个氨基酸(Ser46-GlW82)。DNA序列的长度71 Ibp (403bp-1113bp)。PCR扩增片段741bp，双酶切片段 729bp。FN-C端肝素结合域多肽是由三个相同的III型结构组成(111-12，111-13， 111-14)(图1中的A部分)，包含272个氨基酸(Tyrl720_Tyrl991)，DNA序列的长度 816bp(5428bp-6244bp)。PCR扩增片段83^p，双酶切片段828bp。我们命名两种多肽分别为 rhFNHN^ 和 rhFNHC36。成功构建重组酵母表达质粒pPIC9K-FNH^9和pPIC9K_FNHC36，构建高表达的酵母表达菌株GS115-FNH^9和KM71-FNHC36，发酵液经高心、过柱分离，获得95%以上纯度的 rhFNHN29和rhFNHC36多肽。Western blotting证明多肽可与FN多克隆抗体结合(图1 中的C部分)，具有结合肝素的活性，分子量测定分别为27. 9kDa和31. OkDa (图1中的B部分)。人肝癌细胞系整合素和MMPs的表达方式整合素和基质金属蛋白酶的不同表达显示癌细胞的不同粘附和侵袭能力，影响细胞和胞外基质的相互作用。先前的研究关注这种关系，但肝癌细胞的表达方式却知之较少。 为研究rhFNH拟9和rhFNHC36多肽对肝癌细胞粘附和侵袭能力的影响，我们首次用RT-PCR 方法比较了 MHCC97H细胞和其他类型的肝癌细胞系的整合素和MMPs mRNA的表达。结果显示MHCC97H细胞中无整合素a4mRNA的表达，较低的整合素a 5mRNA表达，高的整合素a v， 整合素β 1，整合素β 3 (见图2Α)，MPP1, ΜΡΡ2，MPP9mRNA的表达(图2B)。总之，MHCC97H 细胞适于作为研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽对肝癌细胞粘附和侵袭能力影响的模型。RhFNHC36和RhFNHN^多肽通过降低整合素α ν β 3抑制MHCC97H的粘附和侵袭根据以上的结果，我们进一步研究了 rhFNHN^和rhFNHC36多肽对MHCC97H细胞的抗粘附和侵袭作用的研究。MHCC97H细胞粘附于FN上依赖于Mn2+，轻微粘附于BSA，I型和IV型胶原。另一方面，(图3A)MHCC97H细胞粘附于FN被抗a V(P2W7)和抗β 3 (BV4) 抗体抑制，但不被抗β 1(8Α》抑制。rhFNHC36多肽抑制粘附呈剂量依赖。rhFNH拟9多肽和FN抑制粘附要大的剂量。rhFNHN^和rhFNHC36多肽不能抑制MHCC97H细胞非特异性粘附至多聚赖氨酸。rhFNH拟9和rhFNHC36多肽抗侵袭中，MHCC97H细胞穿过膜至底部， 被抗a V(P2W7)和抗β 3 (BV4)抗体抑制，不被抗β 1 (8Α2)抑制。提示α νβ 3导致侵袭。 rhFNHC36多肽抑制侵袭呈小剂量，rhFNHN29和FN要大的剂量。(见图由此可见，纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，能很好地在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。RhFNHC36 和 RhFNHN29 多肽降低 MHCC97H 转移我们进一步研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽对MHCC97H细胞在裸鼠肺转移的影响。裸鼠在接种MHCC97H细胞后6周处死，做肺组织病理切片，在显微镜下观察所有样本的肺组织切片。(图4) FN，rhFNHN29和rhFNHC36的平均肿瘤转移灶分别是7. 1 士 1. 1， 7. 3 士 1. 3and 5. 9 士 1. 2，对照是 8. 9 士 1. 6。rhFNHN29 和 rhFNHC36 多肽能有效抑制 MHCC97H 细胞在肺的转移。rhFNHC36多肽的效果较rhFNHN^强(P < 0. 05)。结果显示rhFNHN^ 和rhFNHC36多肽在降低MHCC97H细胞肺的转移起重要的作用。由此可见，纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，能很好地在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。RhFNHC36和RhFNHN^多肽降低整合素表达和MMPs活性为了证明整合素和MMPs表达的改变是否是rhFNHN^和rhFNHC36多肽降低 MHCC97H细胞粘附和侵袭能力的原因。我们测定了 MHCC97H细胞相关整合素表达、MMP-2和 MMP-9的活性。(图5A)结果显示rhFNHN^和rhFNHC36多肽按剂量依赖方式影响整合素 α ν, β 3and β 1的表达。用高浓度rhFNHC36多肽洗QOO μ g/ml)细胞，细胞几乎不表达整合素α ν，β 3，提示rhFNHC36多肽的作用强于rhFNH拟9。另外，rhFNHN^和rhFNHC36多肽对MMP-2的影响不明显。rhFNHC36多肽对MMP-9活性的影响呈剂量依赖方式(图5B)。 说明了 MHCC97H细胞粘附和侵袭被降低的机理。由此可见，纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，能很好地在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。RhFNHC36和IihFNHN^多肽活性与粘着斑激酶磷酸化和活性蛋白(AP-I)相关粘着斑蛋白酪氨酸的磷酸化被认为在整合素调节中发辉着重要的作用。为了进一步说明rhFNHN^和rhFNHC36多肽作用于整合素调节的分子机制，我们检测了 PAO在 rhFNHN29和rhFNHC36多肽抗粘附作用中的意义。(图6A)rhFNHN29和rhFNHC36多肽的抗 MHCC97H细胞粘附至FN作用在加入PAO后而消失，而PAO本身对粘附作用并无影响。接下来，本发明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽对FAK酪氨酸磷酸化和AP-I活性的影响，具体 pl25FAK的免疫印迹和AP-I活性的EMSA。MHCC97H细胞在无血清DMEM培养基中孵育10小时，然后在含与不含氧化砷(ΡΑ0，20μΜ)的DMEM培养基中5分钟，再在DMEM培养基中含 Mn2+ (0. ImM)，及含有与不含有 FN，rhFNHN29andrhFNHC36 (200 μ g/ml) 37°C 20 分钟。提取细胞核蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白，SDS-PAGE胶电泳，电转膜至PVDF膜上，p_FAK(Tyr 397)抗体，再与HRP标记的抗鼠IgG杂交显色。AP-I活性在尼龙膜上免疫印迹，HRP标记探针杂交。我们观察在粘附和移动信息中的FAK(pl25Fffi)酪氨酸的磷酸化和AP-I活性，MHCC97H 细胞在Mn2+’rhFNH^9和rhFNHC36多肽存在下，pl25FAK*和AP-I活性处在低水平，加入PAO 后仍处于低水平。由此可见，纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，能很好地在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。讨论肝细胞癌(HCC)的发生和转移是临床上的重大问题。临床上探讨着能有效抑制癌转移的多种治疗方法。HCC的整合素的表达及细胞外基质与癌细胞的转移密切相关。从细胞外基质的粘附点合成整合素结合多肽进行抗粘附治疗的方法正在研究中。前期的许多研究显示，多种细胞外基质多肽，含RGD细胞粘附序列的合成多肽，其中包括FN，具有抑制癌细胞转移的作用。然后这些短肽的应用却受限于大的剂量和短的半衰期。为了克服这些困难，进行了许多化学修饰的研究，增加其对整合素的亲和力。来源于第14个III型结构的合成多肽，能以多种方式减弱α 5β1调节多种细胞粘附至FN。有人根据整合素α and β 亚单位的保守序列，合成抗粘附多肽(DLYYLMDLSYSMK)。有人证明，利用基因转移技术在体内表达FN的重组CBD-肝素II双功能区域，称CH50，抑制癌的肝转移。然而，这种基因治疗对于肝癌本身的治疗作用却未见研究。我们的研究显示，来源于FN的重组多肽rhFNHN^和rhFNHC36具有抑制MHCC97H 细胞在裸鼠的肺转移作用。这种高功效的解释是长的片段较少降解及没有化学修饰和基因表达对器官的不良作用。其抑制的机制可能是非常复杂的，本发明研究得出以下的机理首先，rhFNHN^和rhFNHC36影响α v and β 3的功能。由于α ν β 3的调节作用， rhFNHN29和rhFNHC36随浓度的改变而抑制MHCC97H细胞向FN的移动及粘附于FN上。前期的研究证实，人类重组FN多肽CH50能干预整合素αν and β 3的表达和活性，进而抑制癌细胞的侵袭和血管的生成。FNIII14也能抑制β 1整合素调节粘附，从而抑制淋巴癌细胞的转移。肝内皮细胞下没有基底膜，肝癌细胞不能象其他癌细胞那样粘附于层粘连蛋白或胶原蛋白。因此，整合素调节HCC转移和细胞粘附于FN在转移的形成中起决定性的作用。 这牵涉到多种FN的受体，如α 4，α 5，α ν和β 1，β 3整合素亚基。其中整合素ανβ3是重要元件，它调节肝癌的侵袭和转移，是由于正常组织的低表达而HCC高表达。肿瘤侵袭和转移的机理研究常与FAK通道有关。本发明在研究rhFNHN^* rhFNHC36影响MHCC97H粘附和侵袭作用中，发现在整合素-FAK-AP-I通道中AP-I的活性调节起重要作用。rhFNHN^和rhFNHC36抑制MHCC97H粘附和侵袭，通过阻断整合素-FAK-AP-I通道。在MHCC97H粘附和侵袭时，由整合素受体诱导的酪氨酸磷酸化酶调节信号通道是最重要的。FAK主要分布在粘附斑结构上，它与细胞粘附，信号转导和其它细胞功能密切相交。整合素α亚其的细胞外区域与ECM，膜上的整合素簇结合后和进一步激活粘附激酶(FAK phosphorylation)和其他蛋白激酶。我们发现当加入特异的FAK抑制剂 (PAO)，p-FAK的表达恢复，提示rhFNHN^或rhFNHC36与整合素α ν β 3相互作用导致进入核内的一系列信号阻断，包括AP-I活性。由AP-I调节的启动子，包括整合素和Miffs的TRE。 它包含AP-I的结合位点，TPA反应元件。在这个研究中，rhFNHC36对整合素和MMP9表达的抑制作用是剂量依赖性的，但rhFNHN 对整合素表达的抑制作用需要较高的浓度。我们推测rhFNHC36较rhFNHN^更有效的理由1)虽然rhFNHN^和rhFNHC36都含有肝素结合区域，rhFNHC36还含有另一个抗粘附点YTIYVIAL。这个抗粘附点深埋在III型结构，但在 rhFNHC36却是外露的。2) AP-I转录因子是亮氨酸拉链蛋白，与一致的DNA序列(5，_TGAG/ CTCA-3’)结合，作为二聚的复合物。不同的AP-I 二聚物与不同的亲和力结合DNA，被认为是不同AP-I复合物具不同生物学作用的部分原因。AP-I 二聚物结合MMP9启动子的能力大于 MMP2。另外，本发明研究的较好效果是因为干预的目标确定。不同的肿瘤细胞有不同的整合素和MMP表达，它与不同的肿瘤侵袭和转移的潜能相关。整合素和MMPs mRNA的表达水平在一组人类肿瘤细胞系中被分析过，肿瘤不同的分化程度，肿瘤形成的潜能，组织侵袭和转移。本发明研究测定了不同肝癌细胞系的整合素和MMPs mRNA的表达水平，发现MHCC97H 细胞中低的整合素α 5mRNA表达，高的整合素α v，整合素β ，整合素β 3，ΜΡΡ1，ΜΡΡ2， MPP9mRNA的表达，部分提示侵袭和转移的机理。提示MHCC97H细胞适于作为研究抗粘附和侵袭作用的模型。
总之，我们的研究提供了第一手证据，证明rhFNH拟9和rhFNHC36通过降低整合素的表达和MPP9的活性，在防治肝癌中的重要作用。是肝癌治疗的新策略。结论本发明研究显示rhFNHN^和rhFNHC36有抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭，解除附着点的酪氨酸的磷酸化，激活活性蛋白(AP-I)的活性，从而降低整合素av，i3 3and β 的表达，降低ΜΜΡ-9的活性。rhFNHN^和rhFNHC36在抗人肝癌细胞转移中起重要作用，是治疗人肝癌的有效新策略。由此可见，纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，能很好地在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。
权利要求
1.一种纤维连接蛋白N-端和/或C-端肝素结合域多肽，在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肝癌细胞为人高转移性肝癌细胞 (MHCC97H)。
全文摘要
本发明公开一种纤维连接蛋白N-端和C-端肝素结合域多肽在制备抗肝癌细胞侵袭转移的药物中应用，具体地说，本发明所述的rhFNHN29和rhFNHC36均能抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭能力，而且抑制MHCC97H细胞的粘附和侵袭能力所需的rhFNHC36浓度更低。这种抑制效应是整合素αvβ3介导的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制剂解除。rhFNHN29和rhFNHC36可以促进FAK酪氨酸磷酸化和AP-1的活性，从而降低整合素αv，β3和β1的表达以及MMP-9的活性。由此可见rhFNHN29和rhFNHC36能作为制备抗肝癌侵袭转移的药物应用，其治疗肝癌细胞侵袭转移具有潜在的良好的应用前景。
文档编号A61K38/39GK102309748SQ20101021577
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者吴勇, 唐南洪, 李秀金, 王晓茜, 邹起练, 陈元仲, 陈燕凌 申请人:福建医科大学附属协和医院