特异性多肤刺激混合物和IL-2扩增HIV-1抗原特异性CD8+T细胞。 实验对铺板后的PBMC进行4种不同的处理，每种处理设置Ξ个复孔作为平行对照，并在细胞 培养的第1天施加相应刺激，其中ΡΗΑ作为阳性对照的刺激物。已突变HIV-1抗原多肤组合的 序列共五条混合:SL9+IL9+RY9+TW10+LY9;未突变HIV-1抗原多肤组合的序列共六条混合： WF9+TV9+化9+EW10+GL9+KF11。两种多肤组合的工作浓度均为化g/mL。比-2的工作浓度均为 lOng/mL，直接加入培养液中。各组具体的处理如下：
将细胞培养板置于5%C02、饱和湿度及37°C的细胞培养箱中进行培养，7天后进行检测 和下一步操作。
[0034] HIV-1抗原特异性CD8+T细胞比例检测和功能性检测 不同刺激组合刺激7天后的PBMC，在细胞培养的7天，对每组细胞进行取样，利用W下流 式抗体:抗人CD8抗体-V450，抗人CD25抗体-APC-切7，对细胞进行染色，检测对HI V-1特异性 多肤组合反应的CD8+T细胞比例。
[0035] 同时，对每组细胞进行取样，利用PBS洗去刺激物，然后将细胞悬浮于含10%胎牛 血清的RPMI1640培养基中，不再继续施加细胞因子，W便让PBMC中激活的细胞重新静息。
[0036] 培养5-7天后，对RPMI1640培养基悬浮细胞计数，离屯、弃上清，无血清RPMI1640培 养基重新悬浮细胞，终浓度为1 X lOVmL。然后将细胞加入预包被干扰素丫抗体的96孔PVDF 实验板中，体积为1〇化17孔，细胞在孔中的分布要尽量均匀。细胞浓度为1 X 105/孔。按照与 此前的预刺激方案，每组细胞加入对应的相同刺激物。其中，负对照孔10化L无血清培养基 为背景，正对照每孔加入10化的PHA，终浓度为化g/mL，实验组分别加入HIV-1抗原多肤组合 刺激物（用RPMI1640配制成10X终浓度，1化L/孔巧峽验孔。当加完所有的样品之后，盖上 板盖，放入37°C，5 % C〇2培养箱培养16-24小时。
[0037] 根据常规的技术，培养16-24小时后，对PBMC细胞进行干扰素丫酶联免疫斑点检测 实验。
[003引各组具体的处理如下:_
结果显示:和已突变多肤刺激效果类似，HIV-1感染患者的PBMC经过未突变抗原肤组合 刺激后，同样使CD25阳性细胞的比例有同等程度的增加，同时酶联免疫斑点实验显示干扰 素丫分泌细胞增加(图3)，即反应了HIV-1抗原特异性CD8+T细胞比例增加（图2)。
[0039] HIV-1感染患者CD8+T细胞的扩增 对HIV-1抗原多肤组合和IL-2刺激7天PBMC，根据常规的技术，进行CD8+T细胞富集分 选:解育CD8+T细胞生物素阴选一抗，20分钟；10倍体积的PBS(含0.5%BSA、2%抓TA)稀释， 混合均匀后，300g 10分钟；解育欧联亲和素的磁珠，30分钟；进行细胞富集，得到CD8+T细 胞，加入含10 %胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度。
[0040] 将分选得到的患者CD8+T细胞悬浮于含10 %胎牛血清的RPMI1640培养基中，细胞 密度为每毫升1-2 X 106细胞，在细胞培养的第7天广泛激活细胞:加入Anti-CD3抗体（lyg/ mU、Anti-CD28抗体（lyg/mL)、化-2( lOng/mL)。培养的第10天，即细胞广泛激活48小时候 后，对铺板后的CD8+T细胞进行巧巾不同的处理，第一种为IL-2,第二种为IL-2和IL-7组合， 第Ξ种为比-2、比-7和比-21组合。
[0041] 在细胞培养的第12天、第14天、第17天、第19天，根据细胞扩增数量，添加新鲜的培 养基，扩大培养体系，维持与之前相同的细胞密度，并施加与第10天相同工作浓度的细胞因 子组合，W维持细胞状态，继续扩增细胞，同时使细胞向记忆细胞方向分化。
[0042] 各组具体的处理如下：
细胞培养第21天，对每组细胞进行细胞计数，用W下公式计算扩增效率。
[0043]
结果显示：相比单独施加化-2和比-2+比-7组合，比-2+化-7+化-21细胞因子组合可W 进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数(图4)。
[0044] 检测HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增后记忆性细胞的比例 在细胞培养的21天，利用W下流式抗体:抗人CD8抗体-V450、抗人CD45RA抗体-ECD、抗 人CD45R0抗体-PerCp-切5.5、抗人CCR7抗体-A1 exa Fluor700、抗人CD6化抗体-PE-切7、抗 人CD122抗体-PE、抗人CD95抗体-APC;对扩增后的CD8+T细胞进行标记，检测CD8+T?细胞和 CDS+Tscm细胞的比例。
[004引结果显示：相比单独施加化-2和化-2+化-7组合，化-化化-7+化-21细胞因子组合 不仅可W进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数，而且使CD8+T?和CDS+Tscm细胞的比 例增加(图5和6)。
[0046]检测HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增后抗原特异性的细胞的比例 在细胞培养的21天，利用加载了 HI V-1 gag蛋白的抗原的四聚体:SL9 (SLYNTVA化)或TV9 (化NAWVLVV)，检测HIV-1抗原特异性的CD8+T细胞的比例。其中，在慢性感染病人中，SL9已 经发生逃逸突变，而TV9未发生逃逸突变。
[0047]结果显示：经过细胞因子组合刺激扩增后，两种HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T 细胞比例均得W维持(图7)。
【主权项】
1. 一种可刺激CD8+ T细胞体外扩增的组合物，其活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28 抗体、IL-2、IL-7和IL-21共5种细胞因子组成。2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:各因子的使用终浓度分别为:Anti-CD3 抗体终浓度0 · 8~1 · 2yg/mL、Anti-CD28抗体终浓度0 · 8~1 · 2yg/mL、IL-2终浓度8~12ng/ mL、IL-7终浓度8~12ng/mL、IL-21 终浓度 18~22ng/mL。3. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:各因子的使用终浓度分别为:Anti-CD3 抗体终浓度lyg/mL、Anti-CD28抗体终浓度lyg/mL、IL-2终浓度10ng/mL、IL-7终浓度10ng/ mL、IL-21 终浓度20ng/mL。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的组合物，其特征在于:该组合物为CD8+ T细胞培养 基。5. -种体外扩增⑶8+ Τ细胞的方法，包括如下步骤： 1) 收集HIV-1感染患者的外周血单个核细胞PBMC经刺激产生的⑶8+Τ细胞； 2) 将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中，待细胞广泛激活后加入活性因子Anti-CD3 抗体、Anti-CD28抗体和IL-2，继续培养至少24h后，继续加入IL-2、IL-7和IL-21中的至少一 种细胞因子，继续培养，扩增CD8+ T细胞。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：使用IL-2和HIV-1抗原多肽组合来刺激 PBMC产生⑶8+ T细胞。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：HIV-1抗原多肽组合为已突变或未突变 ΗIV-1抗原多肽组合，其中，已突变ΗIV-1抗原多肽组合为：SL9 : SLYNT VATL、IL9 : ILKEPVHGV、RY9: RYLRDQQLL、TW10: TSTLQEQIGW和LY9: LYNTVATLY;未突变HIV-1 抗原多肽 组合为：WF9: WASRELERF、TV9: TLNAWVKVV、TL9: TPQDLNTML、EW10: ETINEEAAEW、GL9: GPGHKARVL和KF11: KAFSPEVIPMF。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:将收集的CD8+ T细胞悬浮培养于培养基中 7d后，活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2。9. 根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于：加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2后继续培养48h后，加入IL-2、IL-7和IL-21继续培养，扩增CD8+ T细胞。10. 根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于:Anti-CD3抗体添加的终浓度为lyg/ mL、Anti-CD28抗体添加的终浓度为lyg/mL、IL-2添加的终浓度为10 ng/mL、IL-7添加的终 浓度为10 ng/mL、IL-21添加的终浓度为20 ng/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种可刺激T细胞扩增的组合物，组合物的活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体、IL-2、IL-7和IL-21共5种细胞因子组成。通过HIV-1特异性多肽组合+多重细胞因子组合可有效连续刺激对HIV-1感染者抗原特异性记忆性T细胞（TSCM和TCM）细胞在体外扩增，同时提高了扩增后CD8+记忆性T细胞，尤其是CD8+？TSCM的比例。可以延长过继免疫治疗回输细胞的半衰期，从而延长了其发挥免疫监控的时效，更具有长期控制HIV-1潜伏感染的潜力。该方法具有操作简单、取材容易等优点，为抗感染过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105543170
【申请号】CN201511033813
【发明人】张辉, 刘炳峰
【申请人】中山大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月31日