用于ret融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于RET融合基因检测的引物、探针及 检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】
[0003] 肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各种癌症之首。每年 全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部 的统计，肺癌死亡率为30. 83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。 (Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Oncol, 2003, 14(1) :159-161;中华人民共和国卫生部，《2010年 中国卫生统计》年鉴)。
[0004] 肺癌从组织病理学上可以分为小细胞肺癌（SCLC)和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%。在我国肺 癌患者5年生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测 和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。
[0005]目前化疗仍是肺癌的主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同 患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其 特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。RET基因为原癌基因，定位于第 10号外显子的qll. 2位置，编码一个受体酪氨酸激酶。研宄发现，RET基因在乳头状甲状腺 癌和非小细胞肺癌中还可以和0〇?：6，％(^4，？服41?认，11?頂24，6011^5，11?頂33，1〇^1， ERC1, MBD1 和 TRIM27发生融合，激活下游RAS/MAPK/ERK, PI3K/AKT,和 phospholipase 〇 信号途径，引起癌症的发生（Gainor JF，Shaw AT，The 0ncologist2013;18:865 - 875 )〇
[0006] 以卡博替尼、凡德他尼为代表的药物是针对RET基因融合突变开发的小分子靶向 药物，通过抑制RET酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞 的生长。临床研宄表明卡博替尼对RET融合突变患者的有效率可达61%以上，而对野生型 的患者几乎没有疗效。因此，检测RET融合突变情况是指导卡博替尼类药物用药的前提和 基础，在治疗之前通过高敏度的检测方法检测RET融合基因突变对于提高患者的生存率， 延长生存期，提高生存质量有着重要意义。
[0007] 目前，RET融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交（FISH)法，然而FISH法检 测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本 较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜 过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此， FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可 以同时检测RET多种基因融合的检测方法，以实现快速对RET多种融合突变进行同时检测， 从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的目的：提供一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒，可以 一次同时检测RET基因的17种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成， 同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实 际需求。
[0010] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是： 一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET 基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物 具体为： RET 反转录 1 : TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO ：01 RET 反转录 2 : CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO ：02 RET 反转录 3 : CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：03 Actin 反转录 4: CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO ：04〇
[0011] 所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET-12 基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、（XD1、（XD2、ERC和RET-12基因融合突 变检测特异性引物和探针核苷酸序列、G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突变 检测特异性引物和探针核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检 测特异性引物和探针核苷酸序列、TRM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物 和探针核苷酸序列、KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列 及KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的KIF5B和 RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为： KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO ：05 KIF16F TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO :06 KIF22F CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC SEQ ID NO :07 KIF23F AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC SEQ ID NO :08 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO :09 Taqman Retl2 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:10。
[0012] 所述的(XD1、(XD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序 列具体为： CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO ：11 CCDC2F TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG SEQ ID NO: 12 ERC11F TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG SEQ ID NO: 13 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：14 Taqman Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO: 15。
[0013] 所述的G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针 核苷酸序列具体为： G0LGA7F GAAGCTGATGGGCCAGATACAT SEQ ID NO ：16 NCOA8F CAGGACTGGCTTACCCAAAAG SEQ ID NO: 17 HOOK11F AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG SEQ ID NO: 18 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO: 19 Taqman Retl2 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:20。
[0014] 所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针 核苷酸序列具体为： PCM29F GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT SEQ ID NO ：21 PRKAR7F AATGTGAAATTGTGGGGCATC SEQ ID NO ：22 KTN29F GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG SEQ ID NO : 23 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：24 Taqman Retl2 FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO :25。
[0015] 所述的TRM24、TRM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序 列具体为： TRIM24-9F GCACCTGTGGGTTTACCAAAC SEQ ID NO ：26 TRIM33-16F GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC SEQ ID NO ：27 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO : 28 Taqman Retl2 FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO :29。
[0016] 所述的KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体 为： KIF24F TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG SEQ ID NO ：10 K24R11R TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO: 10 TaqmanK24Rll FAM-5-AAGAGGGCATTCTGCAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO : 30。
[0017] 所述的KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体 为： KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO ：31 K15R11R CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO ：32 TaqmanK15Rll FAM-5-ATCTCCTCAGCTGAGATGAC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:33。
[0018] 上述的用于RET融合基因检测的引物、探针，其中，还包括参考基因特异性引物和 探针核苷酸序列，具体为： ACTBF CTGGCATTGCCGACAGGA SEQ IDN0 ：34 ACTBR AGGAGCAATGATCTTGATCTTC SEQ IDN0 ：35 ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB SEQIDN0:36。
[0019] 一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其中，包括mRNA反转录cDNA体系，所 述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应，所述的mRNA反转录cDNA 体系包括： 5XRT buffer 4M-L 引物终浓度 200nM dNTP ImM superRT 200U RNA 6ML 补DEPC水至 20ML ; 所述的检测试剂盒的PCR反应扩增体系为： 10XPCRBuffer 稀释为IX dNTP 0. 2mM 模板 2uL 各引物 200-400 nM 各探针 100-400 nM 热启动Taq酶 1U MgCL2 2-5mM 总体积 20uL。
[0020] 上述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其中，所述的mRNA反转录cDNA体系 包括如下操作步骤： 步骤1:取逆转录反应混合液13ML，superRT逆转录酶1M1，加入无菌离心管中，混勾。<