一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用，首先利用实时荧光定 量技术检测湖羊Latsl基因在不同生长阶段、不同组织和不同性别的表达特性，继而分析 Latsl基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基 因、MyoG基因六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因的相关性，从而验证Latsl可以作为 湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
【背景技术】
[0002] Lats 基因（Large tumor suppressor gene)(也称 wts 基因），最早由 Xu 等在果 蝇中发现，它可能编码一个丝氨酸/苏氨酸激酶，是一个肿瘤抑制基因，随后它在哺乳动 物中的同源基因也被证实是肿瘤抑制基因，并且是CDKs负调因子家族中的成员。在哺乳 动物中，Lats家族包括Latsl和Lats2两个成员，人类Latsl和Lats2基因分别位于染色 体6q24_25和13qll_12,其编码丝氨酸-苏氨酸激酶在有丝分裂早期与细胞周期调控因子 CDC2激酶构成有丝分裂复合物，参与细胞周期调控，为潜在的肿瘤抑制基因。Latsl缺陷的 小鼠将会引发软组织肉瘤和卵巢肿瘤，缺失Lats2的小鼠将会导致胚胎致死。在体外细胞 培养中，Latsl已经被证明能够将YAP磷酸化。在人正常乳腺上皮细胞中过表达Latsl可降 低YAP介导的上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)和细胞迀移。 在小鼠胚胎成纤维细胞中，Hippo信号通道中Latsl通过Lats2的表达和YAP的稳定性准 确的协调控制细胞生长和染色体的稳定性。Latsl最近被确定为新兴Hippo信号通道中的 一个中心角色，在控制器官大小、肿瘤、干细胞的分化和重建等过程中起着重要的作用。
[0003] 动物的产肉性能包含肌肉细胞的生长和肌纤维的分化。在现有技术中，尚未有研 宄发现以及证明Latsl基因可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用。
[0005] 本方法首先利用实时荧光定量技术检测湖羊Latsl基因在不同生长阶段、不同组 织和不同性别的表达特性，继而分析Latsl基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、 MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因 的相关性，从而验证Latsl可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
[0006] 本研宄选择六个与肌细胞增值和肌纤维分化有关的主效基因作为筛选新的与产 肉性能有关的分子标记的依据，这些主效基因包括：YAP1是一种转录调节因子，它既可以 作为共激活因子，也可以作为辅阻遏物，它是位于Hippo通路下游的关键调节因子，YAP1由 Latsl/2磷酸化，抑制其易位进入细胞核，来调节与细胞增殖、细胞死亡以及细胞迀移相关 的重要因子。研宄表明，YAP1在细胞增殖与凋亡的调控、器官大小的控制、细胞接触性抑制 乃至肿瘤的发生过程中有重要作用。肌肉生长抑制因子（myostatin，MSTN)基因，也被称为 转化生长因子8(GDF-8)，是TGF-0超家族成员之一，在骨骼肌中广泛表达，是肌肉生成中 的一个负调控因子，通过控制成肌细胞的增殖来发挥作用。MSTN可以通过Smad蛋白的介 导抑制成肌细胞的分化。肌细胞生成素（myogenin，MyoG)基因是MRFs基因家族成员，其中 MyoG基因是MyoD家族最重要的成员之一，是肌细胞终末端分化的关键因子，能够在调控肌 细胞生成的过程中起核心作用，其表达可以终止成肌细胞的增殖，调节单核成肌细胞融合 为多核肌细胞的过程，也是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌成肌细胞增殖分化的所有 时期均有表达的基因，是骨骼肌发育的一种正调控因子。肌球蛋白广泛存在于肌细胞中，是 骨骼肌的主要收缩蛋白。肌球蛋白含有两个重链和两对轻链组成，根据肌纤维类型可以分 为多种类型，包括MyHC I、MyHClI A、MyHClI X等。
[0007] 本发明的技术方案是：首先利用实时荧光定量技术分析Latsl基因在湖羊中的 时空表达，继而分析Latsl基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、 MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因的表达相关性。
[0008] 本发明所提供的用于分析Latsl基因在骨骼肌表达的方法，是利用实时荧光定量 技术分析Latsl在不同肌肉组织、不同生长阶段、不同性别的肌肉组织中的表达情况。
[0009] 本发明所提供的用于分析Latsl基因与其他主效基因关联的方法，是分析Latsl 与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基 因在不同肌肉组织表达相关性关系分析，以及Latsl与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生长阶段表达相关性分析。
[0010] 本发明所述的实时荧光定量技术分析Latsl在骨骼肌中的表达情况，是使用 ABI7500荧光定量PCR仪，通过提取总RNA，采用反转录方法获得不同组织样品cDNA，然后进 行实时荧光定量分析。
[0011] 本发明的方法步骤包括：
[0012] 选择三个阶段的试验动物湖羊，包括初生期、断奶期和成熟期的公湖羊和母湖羊； 对每个阶段的湖羊选取饲养条件相同、生长发育良好、体重相近的湖羊进行屠宰。
[0013] 分别采每个阶段湖羊的集背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌四种肌肉组织于 液氮罐保存，然后转移至冰箱冷冻保存。
[0014] 根据GenBank已公布的7种基因（YAP1基因、MyHC I基因、MyHC II A基因、 MyHC II X基因、MSTN基因和MyoG基因和Latsl基因）和内参基因18S的CDS区序列，设计 实时荧光定量PCR引物并合成引物。
[0015] 用Trizol法提取总RNA，用反转录技术合成cDNA。以合成的不同组织样品的cDNA 为模板，根据所设计的基因引物对湖羊不同组织的表达量进行分析。
[0016] 米用SPSS16. 0计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，米用2_ AA Ct方法处理 数据，2- A A Ct表示实验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数分析基因相对表达 差异量。
[0017] 本发明的方法采用实时荧光定量技术，可以检测出Latsl在不同生长阶段、不同 性别、不同肌肉组织中的表达，可以迅速简便的分析Latsl在骨骼肌中的表达情况。本发明 的方法还包括分析Latsl与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X) 基因、MSTN基因、MyoG基因在不同肌肉组织表达相关性关系分析，以及Latsl与YAP1基因、 肌球蛋白重链亚型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生长 阶段表达相关性分析。本发明的方法为研宄湖羊Latsl基因在肌肉生长发育过程中发挥作 用奠定了基础。