鲍曼不动杆菌携带qacE*1-sull基因的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鲍曼不动杆菌携带耐消毒剂qacEA l-sull基因的检测方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002]qacEAl基因是一种耐消毒剂基因，位于I类整合子中，I类整合子是编码抗菌素耐药基因盒的良好载体，暴露于季铵类消毒剂环境下的细菌可因环境压力选择对该类消毒剂耐药。qacEA Ι-sull基因的表达产物为外排泵，可将季胺盐类化合物、双胍类化合物、腙类化合物、碱性染料等排出细菌胞外，从而产生季胺盐类消毒剂和双胍类消毒剂的耐药性，再加上还有sull编码基因，可编码二氢蝶酸合成酶，使细菌对磺胺类药物也耐受。
[0003]革兰阴性杆菌广泛存在于自然界的土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，构成了医院感染的重要病原菌群。鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，属于条件致病菌，随着广谱抗生素的大量应用，分离率呈逐年上升，且耐药模式以多重耐药和泛耐药为主，给临床治疗带来极大挑战。尽管对鲍曼不动杆菌的医院感控措施不断加强，但由其所致的克隆传播或爆发流行仍常有报道，原因与细菌对临床常用消毒剂耐受有关。对临床分离的鲍曼不动杆菌中qacEAl-sull阳性的检出，可为医疗机构提供现有的细菌耐消毒剂状况分析，进而对感染控制措施(清洁卫生和消毒灭菌)做出相应改进。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鲍曼不动杆菌携带耐消毒剂qacE Δ 1-sull基因的检测方法。
[0005]为了达到上述目的，本发明提供了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测耐消毒剂qacE Δ 1-sull基因基因携带情况的方法，其特征在于，具体步骤为:
第一步:从临床分离环境标本中的鲍曼不动杆菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带qacEA Ι-sull基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成qacE Δ 1-sull序列，构建携带qacE Δ 1-sull基因的重组质粒为阳性对照品；全部菌株均使用法国梅里埃公司VITEK32全自动微生物分析仪鉴定菌种。
[0006]第二步:用无菌水配制浓度为5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因正向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因反向引物溶液；qacEA Ι-sull基因正向引物的序列为:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-31 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列为:5'-gcaattatgagccccatacc-3'；
第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE Δ 1-sulI基因正向引物溶液0.5ul、qacE Δ l_sulI基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5_15分钟，92-97 °C 变性 10-30 秒，57-65 °C 退火 10-30 秒，70-75 °C 延伸 10-30 秒，30-50 个循环；HRM反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
[0007]第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，有扩增曲线的即为携带qacE Δ 1-sull 基因。
[0008]本发明是对鲍曼不动杆菌中是否携带耐消毒剂qacEA 1-sull基因进行检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解qacEA Ι-sull基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。
[0009]本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例样本的HRM扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0011]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
[0012]1、从临床分离环境标本中的鲍曼不动杆菌株，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul (浓度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；将标准铜绿假单胞菌株(保藏单位:中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号:ATCC? Number: 27853)，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul (浓度10ng/ul)，作为阴性对照品；人工合成qacEA Ι-sull序列(由上海生工合成)，构建携带qacE Δ Ι-sull基因的重组质粒,稀释至30ul (浓度10ng/ul),为阳性对照品。全部菌株均使用法国梅里埃公司VITEK32全自动微生物分析仪鉴定菌种。
[0013]2、根据qacE Δ Ι-sull基因的保守区域,采用在线软件Primer 3设计引物,确定最佳引物为18-24bp大小，PCR产物长度130bp左右(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为5-15umol/L的qacEA l_sull基因正向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因反向引物溶液；qacEA Ι-sull基因正向引物的序列为:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-3 1 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列为:5 '-gcaattatgagccccatacc-3'；
3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生产，包括 2 X HRM PCR Master Mix、10XPCR 缓冲液、Q-solut1n、EvaGreen Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步骤2所得的qacEA Ι-sull基因正向引物溶液0.5ul、qacEA 1-sull基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤I得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul,用灭菌重蒸懼水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为95°C变性10分钟，95 °C变性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40个循环；HRM反应条件:95°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。
[0014]4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图1所示，阳性对照品有扩增曲线，阴性对照品无扩增曲线，8例检测样品中有2例有扩增曲线，为携带qacEA Ι-sull基因菌株。
【主权项】
1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测鲍曼不动杆菌中耐消毒剂qacEA 1-SUll基因携带情况的方法其特征在于，具体步骤为: 第一步:从临床分离环境标本中的鲍曼不动杆菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带qacEA Ι-sull基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成qacE Δ l_sull序列，构建携带qacE Δ l_sull基因的重组质粒为阳性对照品；全部菌株均使用法国梅里埃公司VITEK32全自动微生物分析仪鉴定菌种； 第二步:用无菌水配制浓度为5-15umol/L的qacEA l_sull基因正向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的qacE Δ 1-sull基因反向引物溶液；qacE Δ 1-sull基因正向引物的序列为:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-31 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列为:5'-gcaattatgagccccatacc-3'； 第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE Δ 1-sulI基因正向引物溶液0.5ul、qacE Δ l_sulI基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5_15分钟，92-97 °C 变性 10-30 秒，57-65 °C 退火 10-30 秒，70-75 °C 延伸 10-30 秒，30-50 个循环；HRM反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒； 第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果,有扩增曲线的即为携带qacE Δ 1-sull基因。
【专利摘要】本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测鲍曼不动杆菌中是否携带耐消毒剂qacE?1-sull基因的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：提取菌株样本DNA，设计目的基因的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因进行分析。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快。
【IPC分类】C12R1-01, C12Q1-68, C12Q1-04
【公开号】CN104745706
【申请号】CN201510159854
【发明人】张奕, 毛丹丹, 王校, 何骏奇
【申请人】上海中优医药高科技有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月7日