当归的检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种当归的检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 当归，是伞形科植物当归Angelica Sinensis (Oliv. )Diels的干燥根，原主产地 在我国甘肃东南部，其中以岷县产量多，质量好，其次为云南、四川、陕西、湖北等省，均为栽 培。国内其它省区也已有引种栽培。其根可入药，是最常用的中药之一。具有补血和血、调 经止痛、润燥滑肠之功效。
[0003] 欧当归和日本当归是常见的当归伪品。欧当归（Levisticum officinalis Koch) 根茎可入药，有兴奋、发汗、利尿、解热等功效，在河北、山东、河南、陕西、山西、江苏等省区 均有种植栽培，民间用以代当归用，但是其有当归不具有的不良反应，不能混充当归药用。 日本当归（Angelica acutiloba(Sieb.et Zucc.)Kitagawa)在我国吉林省的延吉、挥春、和 龙等县栽培作"当归"使用已有长久的历史。国内有些省区也已有引种栽培。模式标本产 于日本中部横须贺近郊，日本和朝鲜以本种称当归，栽培入药。功效与我国原产当归类似， 主治月经不调，经来腹痛，腰痛、崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等症。日本当归化学成分、有效含 量均有较大的差异，而且在药理作用上也有较大的不同之处。
[0004] 总之，欧当归和日本当归本的药效和当归虽有相似之处，但是在很多功效上有区 另IJ，且存在用药安全性问题，不能作为当归使用，然而，由于欧当归、日本当归与当归的性状 特征较为相似，通过观察外观形状和显微特性进行鉴别的难度较大，而且欧当归和日本当 归易于栽培，产量较高，导致市面上存在许多用欧当归和日本当归以次充好的情况，急需改 善。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、方便、快速、准确地检测当归 的试剂盒和方法。
[0006] 本发明提供了 SEQ ID NO. 1所示的种核苷酸序列。
[0007] 本发明还提供了检测SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中 的用途。
[0008] 所述检测SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列的试剂。
[0009] 所述当归是伞形科植物当归Angelica Sinensis (Oliv. )Diels的干燥根。
[0010] 所述当归是甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归或四川绵 阳当归。
[0011] 所述扩增的试剂包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物对。
[0012] 本发明检测当归的试剂盒，包括检测SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相关试剂。
[0013] 所述试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的试剂。
[0014] 所述扩增的试剂包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物对。
[0015] 本发明一种当归的检测方法，包括如下步骤：
[0016] a，DNA提取：提取待检样本中的DNA ;
[0017] b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。
[0018] 本发明SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列为当归特异性序列，通过检测这些序列可以 有效区分当归与当归伪品，鉴定待检样本是否为当归，保证用药安全，本发明方法操作简 便，具有良好的应用前景。
[0019] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限 制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述 基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内 容。
【附图说明】
[0020] 图1.各种当归的改良RAPD扩增。引物SBS-A1的RAPD扩增。箭头为A1-0的RPAD 片段，用于胶回收和克隆。
[0021] 图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。蓝色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通 道"M"显示有分子重量（bp)的DL2000DNA标记。泳道1-7分别代表不同阳性克隆的菌落。
[0022] 图3不同物种及当归品种的鉴定。通道1-18号分别为甘肃岷县当归，日本当归， 四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳 当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。蓝色所指的通道7为日 本当归，通道2为欧当归。通道"M"显示有分子重量（bp)的DL2000DNA标记。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1 RAPD技术扩增当归特异SCAR标记
[0024] 一、CTAB法提取植物DNA
[0025] 取当归0. 2g置于1. 5mL EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立 即加入 500 y 1 的 CTAB 提取缓冲液[CTAB2%，Tris-HCl (pH8. 0) lOOmmol. L」，EDTA20mmol mmo 1. L」，NaCL 1. 4mo 1. L」，0. 4 %的0 -巯基乙醇]，60 °C水浴保温1小时后，加入等体积的 氯仿-异戊醇（24 :1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清 加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清， 小心倾去上清液，沉淀用70%乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用 100 y 1的1XTE溶液溶解备用。将样品用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用 分光光度计测定浓度，稀释至浓度l〇ng/yl，-20°C保存备用。详见《精编医学分子生物学 实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）。
[0026] 二、RAPD 技术 PCR 扩增
[0027] 利用 RAPD 技术进行扩增（参照 Fu J, Yang L, Khan MA, Mei Z (2013) Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis. Mol Biol Rep, 40(10):5993-9)：
[0028] 以步骤一提取的核酸作为模板，用RAH)引物SBA-A1和SBS-A2进行扩增（序列见 表2,北京赛百盛公司合成），PCR扩增采用10yl反应体系包括：lyl的引物（2. 5ymol/ 1)，1.5 1^1(15叩）模板0嫩，5 1^1的2\?〇?139]\&^61'11^(天根生物公司，北京）和 2. 5 y 1的灭菌双蒸水。充分混勾后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪（Applied BiosystemsVeriti?96-Well Thermal Cycler，Life Technology, USA)。PCR 反应条件是： 95°C 1分30秒，94°C 40秒，36度60秒，72°C 1分30秒，40个循环，最后72°C 5分钟，其中 RAMP为5%。然后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。
[0029]表 1
【主权项】
1. SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2. 检测SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所 示核苷酸序列的试剂。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述扩增的试剂包括SEQ ID NO. 2~3所 示的引物对。
5. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述当归是伞形科植物当归Angelica Sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根。
6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述当归是甘肃岷县当归、甘肃平凉当 归、四川九寨当归、云南丽江当归或四川绵阳当归。
7. -种检测当归的试剂盒，其特征在于：包括检测SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相 关试剂。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列的试剂。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增的试剂包括SEQ ID NO. 2~3 所示的引物对。
10. -种检测当归的检测方法，其特征在于：包括如下步骤： a，DNA提取：提取待检样本中的DNA ; b，检测：用权利要求7~9任意一项所述的试剂盒检测待检样本，即可。
【专利摘要】本发明公开了当归的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途，以及当归的检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别当归，特异性强，耗时短，应用前景良好。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104745699
【申请号】CN201510142132
【发明人】傅俊江, 梅志强, 张春, 成竞梁
【申请人】泸州医学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月27日