检测nf1基因第31-34号全外显子的方法和引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NF1基因第31-34号全外显子 突变的引物和方法
【背景技术】
[0002] 幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少 见的儿童慢性髓系白血病，恶性程度高，兼有骨髓增生异常综合征（myelodysplastic，MDS) 和骨髓增殖性疾病（myeloproliferative disease，MPD)的特征。目前发现RAS信号通路 中RAS，PTPN11，NF1，CBL 4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶 向治疗是目前研宄的方向。
[0003] NF1基因定位于染色体17qll. 2,跨距350kb长的基因组DNA，包含60个外显子， 可转录成11~13kb的mRNA,其蛋白产物为神经纤维瘤素。其中8 457bp的读码框架，编 码包含2818个氨基酸的神经纤维蛋白，相对分子质量为327X 103。NF1基因这样大的长 度与其很高的自发突变率及临床表现的复杂性相一致。NF1基因突变类型呈多样化，包括 碱基置换、插入突变、缺失突变、重复突变、无义突变、错义突变、框架漂移等均有报道，大 部分突变产生截短蛋白，仅有10%与氨基酸替代有关，国外研宄结果显示，NF1基因并不存 在突变热点。
[0004] I型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1)NF1是一种常染色体遗传 病，临床特点为：多系统、多器官损伤，主要特征为皮肤牛奶咖啡斑和多发性皮肤软组织纤 维瘤，由NF1基因突变引起。NF1患儿具有极高的并发髓系肿瘤风险，尤其是，JMML，并且相 对未发生NF1者，JMML患儿年龄偏大，有文献报道，诊断JMML者，约11 %伴有NF1，无NF1者 约10%~15%存在即1基因缺失。近来3丨6；[11611^1111等研宄发现，合并即1的15例】丽1 患儿2/3存在杂合子NF1基因缺失，且绝大多数该基因染色体存在单亲二倍体，少数为染色 体中间缺失，剩余1/3患儿存在复合杂合子突变，进一步证实了 NF1功能缺失在NF1发展为 JMML中起重要作用。
[0005] 幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种 少见的儿童慢性髓系白血病，占儿童期白血病的1 %~2%。国外文献报道JMML的年发病 率为（0. 12~0. 30)八1 X 104)，美国每年新发JMML为25~50例，我国迄今尚无关于JMML 发病率研宄的确切流行病学资料。目前发现RAS信号通路中RAS，PTPN11，NF1，CBL4种基 因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶向治疗是目前研宄的方向。RAS、 PTPN11、NF1及CBL4种基因突变约占JMML患儿80%~85%，其中PTPN11约占35%，NF约 占11%，1(狀5^狀5两者占17%~30%，〇81占10%~17%。诊断了丽1者，约11%伴有 NF1，无NF1者约10%~15%存在NF1基因缺失。
[0006] 多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验（PTT)、单链构象多态性（SSCP)、异源 双链分析（HA)、变性梯度凝胶电泳（DGGE)和温度梯度凝胶电泳（TGGE)等均被应用于NF1 基因突变的检测，但所有这些方法均有一定的局限性，从而限制了基因突变的检出率。目 前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于NF1基因容量大、突变 类型多、突变率高、突变位点散在分布，故而阻止了对NF1基因突变的深入研宄，荧光定量 PCR法并不适用。
[0007] 本发明采用Sanger测序法检测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变，并且设 计的引物可以扩展整个第31，32, 33, 34号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直 观的了解NF1基因第31-34号全外显子的基因突变情况，并不受NF1基因的基因突变多样 化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
【发明内容】
[0008] 本发明提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用 于快速检测JMML患者体内检测NF1基因第31-34号全外显子突变的情况。
[0009] 本发明的目的在于提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，包括：扩增覆盖 检测NF1基因第31-34号全外显子突变的3对正、反向引物；其碱基序列为：
[0010] NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0011] NF1_R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0012] NFl_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0013] NFl_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0014] NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
[0015] NF1_R34 ； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG〇
[0016] 进一步地，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为
[0017] NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0018] NF1_S-R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0019] NFl_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0020] NFl_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0021] NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
[0022] NF1_S-R34 ;CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
[0023] 进一步地，所述3对正、反向引物的使用浓度比为：NF1_F31:NF1_R31 = 1:1 ;NF1_ F32-33 ：NFl_R32-33 = 1:1 ；NF1_F34 ：NF1_R34 = l:l〇
[0024] 进一步地，所述3对测序引物的使用浓度比为：
[0025] NF1_S-F31:NF1_S-R31 = 1:1 ;NFl_S-F32-33 :NFl_S-R32-33 = 1:1 ;NF1_S-F34 : NF1_S-R34 = l:l〇
[0026] 本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的方法，其包括 如下步骤：
[0027] (1)提取样品 DNA ;
[0028] (2)利用 3 对扩增引物 NF1_F31 与 NF1_R31，NFl_F32-33 与 NFl_R32-33,及 NF1_ F34与NF1_R34对⑴中的DNA进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子突变 的得扩增产物；
[0029] (3)利用 3 对测序引物 NF1_S-F31 与 NF1_S-R31，NF1_S-F32_33 与 NFl_S-R32-33， 及NF1_S-F34与NF1_S-R34对⑵中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物 的基因序列；
[0030] (4)将（3)中的基因序列与野生型RUNX1基因序列进行比较，确定突变位点是否存 在；其中所述引物序列为：
[0031] NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0032] NF1_R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0033] NFl_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0034] NFl_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0035] NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
[0036] NF1_R34 ； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
[0037] NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0038] NF1_S-R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0039] NFl_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0040] NFl_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0041] NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
[0042] NF1_S-R34 ； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
[0043] 本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反 应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物 NF1_F31 与 NF1_R31，NF1_F32_33 与 NFl_R32-33 及 NF1_F34 与 NF1_R34,测序体系包括 3 对 测序引物 NF1_S-F31 与 NF1_S-R31，NFl_S-F32-33 与 NFl_S-R32-33,及 NF1_S-F34 与 NF1_ S-R34,包括：
[0044] NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0045] NF1_R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0046] NFl_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0047] NFl_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0048] NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
[0049] NF1_R34 CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
[0050] NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
[0051] NF1_S-R31 ； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
[0052] NFl_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
[0053] NFl_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
[0054] NF1_S-F