GAGTAACAAGCT SEQ ID NO ：49 RefR AATTCCCAAGGACCACCTCAC SEQ ID NO : 50 Ref-Taqman FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQIDN0:51。
[0012] 一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其中，通过所述的检测试剂盒提取DNA样 本，并进行PCR反应，所述的PCR反应扩增体系如下： 10XPCRBuffer 稀释为IXdNTP 0. 2mM 模板 2uL 各引物 200-400 nM 各探针 100-400 nM 各封闭探针 200-400 nM 热启动Taq酶 1U MgCL2 2-5mM 总体积 20uL。
[0013] 上述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其中，所述的PCR反应的条件如下。
【主权项】
1. 一种用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：包括全RAS的特异引物与探 针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、 4外显子的23种突变类型； 所述的KRAS外显子2的12,13外显子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID N0.0 1 K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID N0.0 2 K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID N0.0 3 K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID N0.0 4 K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID N0.0 5 K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID N0.0 6 K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID N0.0 7 K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID N0.0 8 K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID N0.0 9 K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO. 10 K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO. 11 K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO. 12 KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO. 13 KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO. 14 KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 15 ; 所述的KRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO. 16 K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO. 17 K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO. 18 K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO. 19 K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO. 20 K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO. 21 K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO. 22 K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO. 23 K18IffTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO. 24 K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 25 ； 所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： K349-1B-1 5-ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG-3 SEQ ID NO. 26 K350-1B-1 5-ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG-3 SEQ ID NO. 27 K351-1B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC-3 SEQ ID NO. 28 K351-2B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT-3 SEQ ID NO. 29 K349R 5-ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT-3 SEQ ID NO. 30 KWT349MGB1 5-GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA-3-MGB SEQ ID NO. 31 K349Taqman FAM-5-ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 32 ; 所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针体为： K436-1B 5-GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3 SEQ ID NO. 33 K436-2B 5-TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG-3 SEQ ID NO. 34 K437-1B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC-3 SEQ ID NO. 35 K437-2B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA-3 SEQ ID NO. 36 K436R 5-TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC-3 SEQ ID NO. 37 KWT436MGB 5-CTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3-MGB SEQ ID NO. 38 K436Taqman FAM-5- ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 39 ; 所述的NRAS外显子2的12,13编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N34-1B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAA-3 SEQ ID NO. 40 N34-2B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAC-3 SEQ ID NO. 41 N34-3B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAT-3 SEQ ID NO. 42 N35-1B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGA-3 SEQ ID NO. 43 N35-2B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGC-3 SEQ ID NO. 44 N35-3B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGT-3 SEQ ID NO. 45 N37-1B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTA-3 SEQ ID NO. 46 N37-2B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTC-3 SEQ ID NO. 47 N37-3B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3 SEQ ID NO. 48 N38-1B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO. 49 N38-2B 5-GTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO. 50 N38-3B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO. 51 N34R 5-CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT-3 SEQ ID NO. 52 N34taqman FAM-5- AAGCGCACTGACAATCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 53 NWT34MGB 5-GTTGGAGCAGGTGGTGTTG-3-MGB SEQ ID NO. 54 ； 所述的NRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N181R 5-ATGGCAAATACACAGAGGAAGC-3 SEQ ID NO. 55 N181-1B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAA-3 SEQ ID NO. 56 N181-2B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAG-3 SEQ ID NO. 57 N181-3B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAT-3 SEQ ID NO. 58 N182-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACC-3 SEQ ID NO. 59 N182-2B 5-ATACTGGATACAGCTGGACG-3 SEQ ID NO. 60 N182-3B 5-ACATACTGGATACAGCTGGACT-3 SEQ ID NO. 61 N183-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAC-3 SEQ ID NO. 62 N183-2B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAT-3 SEQ ID NO. 63 N18ITaqman FAM-5- AATACATGAGGACAGGCG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 64 NWT18IMGB 5-GATACAGCTGGACAAGAAGAG-3-MGB SEQ ID NO. 65 ； 所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N436-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAA-3 SEQ ID NO. 66 N437-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT-3 SEQ ID NO. 67 NWT436MGB 5-ATTGAAACCTCAGCCAAGAC-3-MGB SEQ ID NO. 68 N436R 5-GAATATGGATCACATCTCTACCAG-3 SEQ ID NO. 60 N436Taqman FAM-5-ACAGCTTTCAGCATTTGTG-3-BHQ-MGB SEQIDN0.70。
2. 根据权利要求1所述的用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：还包括人类 基因组野生型位点引物，FAM-MGB Taqman探针，参考加样孔具体为： RefF CCAAGGCACGAGTAACAAGCT SEQ ID NO ：49 RefR AATTCCCAAGGACCACCTCAC SEQ ID NO : 50 Ref-Taqman FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO ：51〇
3. -种的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：通过所述的检测试剂盒提 取DNA样本，并进行PCR反应，所述的PCR反应扩增体系如下： 10XPCR Buffer 稀释为 IX dNTP 0. 2mM 模板 2uL 各引物 200-400 nM 各探针 100-400 nM 各封闭探针 200-400 nM 热启动Taq酶 IU MgCL2 2-5mM 总体积 20uL。
4. 根据权利要求3所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR 反应的条件如下。
5. -种用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法至少包括 如下步骤： 步骤1 :针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针； 步骤2 :样本处理与DNA的提取； 步骤3 :建立PCR扩增反应体系； 步骤4 :分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
6. 根据权利要求5所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于： 所述的DNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织。
7. 根据权利要求5所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于： 取样的所述的DNA样本为1克。
【专利摘要】本发明公开了一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，提取DNA样本并进行PCR反应。本发明采用特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；利用MGB Blocker阻滞NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高灵敏度，大于ARMS的1%；可在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104762410
【申请号】CN201510215782
【发明人】张道允, 巩子英
【申请人】上海允英医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月29日