述PCR引物对H4的所述H4-F和所述H4-R的摩尔数可 为 1:1〇
[0043] 本发明中的Premix Ex Taq可为大连宝生物工程有限公司产品。
[0044] 本发明中的PCR反应均可在Roche公司的LightCycler 2. 0PCR仪中进行。PCR反 应的条件均可为：94°C预变性30s ;94°C变性10s，60°C退火延伸20s，40个循环。
[0045] 实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试 剂具有较高的灵敏度、特异性和重复性，且受不同模板浓度间差异的影响小：本发明的成套 试剂能检测出1〇 3拷贝/20 y L的H3亚型禽流感病毒；本发明的成套试剂能检测出100拷贝 /20 y L的H4亚型禽流感病毒；本发明的成套试剂可特异鉴定H3亚型禽流感病毒或H4亚 型禽流感病毒，并且重复性好，在批内重复性实验中FAM通道（在530nm激发光下）Ct值变 异系数为0.29%，R0X通道（在610nm激发光下）Ct值变异系数为0.24%。在批间重复性 实验中，FAM通道和ROX通道的Ct值变异系数分别为0. 51%和1. 2% ;本发明的成套试剂 鉴定H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒时，不同模板间的差异对结果的干扰小。实 验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂鉴定 H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒，反应结束时即可根据扩增曲线判定待测样品是 否含有H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒，具有特异性强、假阳性低、灵敏度高（是 常规PCR的100倍以上）、操作简单、交叉污染和污染环境的机会少（不需要EB染色）等优 点，而且整个反应可在30min左右完成，省时省力，并且还可同时检测多个毒株（如H3亚型 和H4亚型禽流感病毒）。实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流 感病毒的成套试剂可用来鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒。
【附图说明】
[0046] 图1为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 特异性实验FAM通道结果。其中，1为H1亚型禽流感病毒，2为H3亚型禽流感病毒，3为H4 亚型禽流感病毒，4为H5N2亚型禽流感病毒，5为H6亚型禽流感病毒，6为H7N2亚型禽流感 病毒，7为H9亚型禽流感病毒，8为新城疫病毒（NDV)F48E9,9为传染性支气管炎病毒（IBV) H52,10为传染性喉气管炎病毒（ILTV)北京株，11为鸡毒支原体（MG)S6,12为禽呼肠孤病 毒（ARV)S1733,13为阴性对照。
[0047] 图2为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 特异性实验R0X通道结果。其中，1为H1亚型禽流感病毒，2为H3亚型禽流感病毒，3为H4 亚型禽流感病毒，4为H5N2亚型禽流感病毒，5为H6亚型禽流感病毒，6为H7N2亚型禽流感 病毒，7为H9亚型禽流感病毒，8为新城疫病毒（NDV)F48E9,9为传染性支气管炎病毒（IBV) H52,10为传染性喉气管炎病毒（ILTV)北京株，11为鸡毒支原体（MG)S6,12为禽呼肠孤病 毒（ARV)S1733,13为阴性对照。
[0048] 图3为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 敏感性实验FAM通道结果。其中，1为10 9拷贝/20 y L的T-H3溶液，2为10 8拷贝/20 y L 的T-H3溶液，3为107拷贝/20 y L的T-H3溶液，4为10 6拷贝/20 y L的T-H3溶液，5为10 5 拷贝/20 y L的T-H3溶液，6为104拷贝/20 y L的T-H3溶液，7为10 3拷贝/20 y L的T-H3 溶液，8为阴性对照。
[0049] 图4为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 敏感性实验R0X通道结果。其中，1为10 9拷贝/20 y L的T-H4溶液，2为10 8拷贝/20 y L 的T-H4溶液，3为107拷贝/20 y L的T-H4溶液，4为10 6拷贝/20 y L的T-H4溶液，5为10 5 拷贝/20 y L的T-H4溶液，6为104拷贝/20 y L的T-H4溶液，7为10 3拷贝/20 y L的T-H4 溶液，8为阴性对照。
[0050] 图5为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 重复性实验FAM通道结果。其中，1-3为三个平行实验，4为为阴性对照。
[0051] 图6为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的 重复性实验R0X通道结果。其中，1-3为三个平行实验，4为为阴性对照。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0053] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0054] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 下述实施例中的H1亚型禽流感病毒（利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型 禽流感病毒及N1、N2亚型的分型，病毒学报，2013, 29 (2) : 154-159)公众可从广西壮族自治 区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0056] 下述实施例中的H3亚型禽流感病毒（Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay，Virology Journal, 2011，5 ;8:337)公众可从广西壮族自治区兽医 研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0057] 下述实施例中的H4亚型禽流感病毒（H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜 蛋白基因的序列测定和遗传进化分析，畜牧兽医学报，2006, 37 (12)，1334-1339)公众可从 广西壮族自治区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为 其它用途使用。
[0058] 下述实施例中的H6亚型禽流感病毒（H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方 法的建立，畜牧与兽医，2012, 44(11)，12-16)公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得，该 生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0059] 下述实施例中的H9亚型禽流感病毒（多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9 亚型禽流感病毒方法的建立，中国人兽共患病学报，2006，（09) :858-860)公众可从广西壮 族自治区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用 途使用。
[0060] 下述实施例中的H5亚型禽流感病毒（H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技 术的建立，南方农业学报，2013, 02:323-327)的RNA由美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断 研宄室提供，公众得到美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研宄室同意后可从广西壮族自治 区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0061] 下述实施例中的H7亚型禽流感病毒（H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶 链反应快速检测及鉴别方法的建立，中国兽医科技，2005, 35 (6)，437-440)的RNA由美国宾 夕法尼亚州立大学禽病诊断研宄室提供，公众得到美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研宄 室同意后可从广西壮族自治区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所 用，不可作为其它用途使用。
[0062] 下述实施例中的新城疫病毒（NDV)F48E9(禽流感和新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR检测方法的建立，生物技术通讯，2008, 19(3)410-413)公众可从广西壮族自治区兽 医研宄所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0063] 下述实施例中的传染性喉气管炎病毒（ILTV)北京株（应用多重反转录聚 合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研宄，中国预防兽医学报， 2000, 22 (2)，126-130)公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得，该生物材料只为重复本 发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0064] 下述实施例中的鸡毒支原体（MG) S6 (用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的 结构蛋白，中国兽医科技，2003, 33 (2)，41-43)公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得， 该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0065] 下述实施例中的禽呼肠孤病毒（ARV)S1733(禽呼肠孤病毒广西分离株〇 3基因的 克隆和表达，中国预防兽医学报，2005, 27 (3)，167-170)公众可从广西壮族自治区兽医研宄 所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0066] 下述实施例中的DNA