专利名称：产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。
背景技术：
共轭亚油酸(CLA)属于十八碳二烯酸，是亚油酸(LA)的异构体，包括二十余种组分。其中对顺式_9，反式-11共轭亚油酸和反式-10，顺式-12共轭亚油酸(trans-10，cis-12 ；tl0cl2-CLA)异构体的生物学活性比较清楚。对tl0cl2_CLA来说，它能够促进身体的代谢，抑制脂肪的合成，能减少肥胖症的发生概率。2008年，美国FDA颁发食品许可证，同意将CLA作为食品添加剂使用。目前，CLA已经被许多食品和制药企业作为保健品生产并出售。自然界中，牛、羊体内的一些瘤胃微生物有合成CLA的能力，这些CLA能够进入乳汁中，一升牛奶的CLA总量在1.4克左右，其中tl0cl2-CLA的比重小于10%。工业上，将亚油酸碱性异构化后生成CLA，产物是混合物的形式，除了上述两种CLA组分外，还含有多种异构体杂质，杂质的含量甚至能达到30%以上，这些杂质如果进入人体，容易通过花生四烯酸代谢途径衍生出多种有负面生物学效应的共轭类异构体。可以看出，如果食品中添加的CLA不含有杂质、成分单一的话，更有利于消费者的健康。在生物技术的支撑下，利用微生物大量生产CLA的单一组分，是一个比较理想的途径。研究发现，自然界的一些低等菌类具有自身合成tl0cl2-CLA组分的能力，例如，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶 PAI (Propionibacterium acnesisoenzyme)就能够将亚油酸LA异构成tl0cl2_CLA。密码子优化的pai基因，能够在哺乳类细胞中异源表达，也可以将亚油酸转化成tl0cl2-CLA成分(苟克勉，李世丽，亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途，专利申请号:201110112685.5)。但目前还未有tl0cl2_CLA转化效率高的重组食品级微生物的报道。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。本发明所提供的一株tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌，是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7148。本发明所提供的构建tl0cl2_CLA的转化效率高重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为 宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤；所述蛋白质PAI为如下a)或b)的蛋白质:a)由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQ ID N0.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a)衍生的蛋白质。其中，所述蛋白质PAI具有亚油酸异构酶活性。SEQ ID N0.2由424个氨基酸残基组成。上述方法中，所述tl0cl2_CLA的转化效率是指所述宿主菌或重组乳酸乳球菌以亚油酸为底物，培养得到的菌体中的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的质量与菌体中反式-10，顺式-12共轭亚油酸和亚油酸质量之和的比值。所述蛋白质PAI的编码基因具体可为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)其编码序列是SEQ ID N0.1的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质PAI的DNA分子；3)与I)限定的DNA分子具有90%以上的一致性且编码所述蛋白质PAI的DNA分子。其中，SEQ ID N0.1由1275个核苷酸组成，其编码序列是第1-1275位。上述方法中，所述宿主菌为食品级乳酸乳球菌和/或其衍生菌株。所述蛋白质PAI的编码基因通过重组食品级表达载体导入所述宿主菌中。其中，所述食品级乳酸乳球菌是指可食用的乳酸乳球菌，可为乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等。所述重组食品级表达载体是筛选标记为食品级筛选标记的表达载体，所述食品级筛选标记具体可为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IacF基因。上述方法中，所述食品级乳酸乳球菌可为乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等，所述重组食品级表达载体可为表达所述蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载体。进一步，所述重组食品级表达载体具体可为将所述蛋白质PAI的编码基因插入PNZ8149的多克隆位点得到的重组表达载体。上述任一所述方法构建的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌也属于本发明的保护范围。本发明还提供了表达所述蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载体。其中，所述重组食品级表达载体具体可为将所述蛋白质PAI的编码基因插入PNZ8149的多克隆位点得到的重组表达载体。
本发明所提供的tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌具体可为食品级乳酸乳球菌，优选为基因工程方法生产的重组型乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌整合了外源的亚油酸异构酶PAI基因，该菌株能够表达亚油酸异构酶，该酶能够将亚油酸生物催化成反式-10，顺式-12共轭亚油酸。本发明的实验证明，将已申请发明专利(苟克勉，李世丽，亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途，专利申请号:201110112685.5)所述的PAI的编码基因，插入食品级表达载体pNZ8149中，然后转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900,进而获得稳定表达PAI基因的食品级重组乳酸乳球菌，能够有效地生产tl0cl2-CLA，产物tl0cl2_CLA的含量占菌体脂肪酸总量的15.19-23.91% ;其中，效果最好的重组菌株中，tl0cl2-CLA含量超过了菌体脂肪酸总量的23.91%，底物亚油酸异构成产物tl0cl2-CLA的转化效率超过了37.6% ;本发明为利用重组乳酸乳球菌生产tl0cl2-CLA的相关应用提供了方法和菌株。生物材料信息分类命名:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株编号:PA1-75保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称:CGMCC地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期:2013年01月18日保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7148下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
图1为各菌株的菌体中亚油酸和反式-10，顺式-12共轭亚油酸占菌体总脂肪酸的
百分含量。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900 (购自德国Mo Bi Tec公司)，是食品级菌株，为乳糖缺陷型菌株，不能利用乳糖，只能在含葡萄糖的培养基中生长。pNZ8149 (购自德国Mo Bi Tec公司)，是食品级表达载体，含有代谢乳糖的基因。实施例1、构建tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌本实施例以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900作为宿主菌，以PNZ8149-PAI作为重组食品级表达载体为例，阐明构建tl0cl2_CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌的方法。该方法将pNZ8149_PAI转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900菌后，利用乳糖培养基筛选重组菌株，能够生长的重组菌体就可能携带外源的pai基因，这个基因表达的PAI异构酶会将亚油酸转化成tl0cl2-CLA。这个表达系统避免了抗生素的使用，也不产生内毒素，是一种高效的食品级载体表达系统。在此，通过上述实验原理和方法，将pai基因通过食品级表达载体导入食品级乳酸乳球菌中，获得了能够生产tl0cl2-CLA的食品级工程菌株。具体如下:1、表达蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载PNZ8149-PAI的构建为了将SEQ ID N0.1所示的优化pai基因插入pNZ8149质粒，设计PCR弓丨物(sense:5f _aaa act gca gcc atg age att agt aag gac age a_3，, ant1-sense:5f -eggggt acc tta gac aaa gaa ccg ggt cac ca_3’)，在上下游引物间分别引入了 Pst I 和Acc651酶切位点，以SEQ ID N0.1所示的优化pai基因为模板，用高保真pfu酶(天根生化科技有限公司)扩增SEQ ID N0.1所示的优化pai基因，PCR条件是:95°C，5min ;94°C，30sec，60°C，30sec, 72°C，150sec,共 32 个循环；72°C, IOmin0 获得的 PCR 产物用 Pst I 和 Acc651双酶切后，电泳回收片段通过Pst I和Acc651双酶切位点连接到pNZ8149质粒(购自德国MoBiTec公司)上，构建成pNZ8149-PAI质粒，酶切鉴定和DNA测序证明，pNZ8149_PAI中的优化pai基因的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1所示的优化pai基因编码SEQID N0.2 的蛋白 PAI。常规的苯酚/氯仿/异戊醇抽提法纯化pNZ8149-PAI质粒，用于转化食品级乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900。2、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900普通培养和感受态细菌的准备参照德国MoBiTec公司产品说明书(http: //www.mobitec.com/download/handbook/VS-NICE Handbook, pdf )操作。具体地，_80°C冰箱解冻的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900,按1%稀释接种至5毫升的基础培养液(Ml7肉汤+0.5M蔗糖+2.5%甘氨酸+0.5%葡萄糖)中，30°C静置培养；第二天将此5毫升溶液再用50毫升上述基础培养液稀释，30°C静置培养；第三天将上述25毫升培养液稀释到200毫升新鲜基础培养液中，继续培养，当菌液的OD6tltl值达到0.2-0.3时，收集菌体，4°C离心(6000Xg，20min)后，用200毫升的0.5M蔗糖+10%甘油溶液重悬沉淀菌体，继续离心(6000 X g, 20min);再用100毫升的0.5M蔗糖+10%甘油+50mM EDTA溶液重悬菌体，冰浴15min ;4°C继续离心(8000 X g，20min)，用50毫升0.5M蔗糖+10%甘油溶液洗涤沉淀的菌体，4°C离心(6000Xg，20min) 后，用2毫升0.5M蔗糖+10%甘油溶液重悬菌体，40微升分装到预冷的1.5-mL的微型离心管中置于冰上待用，或液氮速冻后保存于_80°C冰箱。3、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900的电转化及重组菌落的鉴定上述步骤2准备的40微升乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900感受态细胞中，加入步骤I制备的5微升pNZ8149-PAI纯化质粒，轻轻混匀后，转移到2_mm的电转杯(美国Bio-Rad公司)中，冰浴5分钟后，使用Gene pulser X-cell型电转仪(美国Bio-Rad公司)进行电转化，电转参数是:2000V，200 Ω，25 μ F ;随后，立即加入I毫升溶液(步骤2所述基础培养液+20mM MgCl2+2mM CaCl2)中，冰浴5分钟；然后，30°C静置培养约I小时；吸取适量复苏的菌液，涂布于Elliker固体培养基(含0.004%溴甲酚紫指示剂和0.5%乳糖)上，30°C恒温培养36-48小时，筛选单克隆转化菌落，其中，阳性菌落周围培养基呈黄色。将上述的阳性单克隆菌落挑至I毫升溶液(M17肉汤+0.5%乳糖)中，30°C过夜培养；第二天，吸取其中的200微升溶液离心，再用50微升裂解液(4M盐酸胍+50mMEDTA+50mM Tris-HCl+10mM DTT)重悬，沸水浴煮15分钟，离心并用蒸馏水洗涤两次，最后用20微升蒸馏水重悬，取I微升用作菌体PCR扩增pai基因的模板。设计pai基因内部一对特异性弓I物(sense:5，-caggattccacgattacac-3J , ant1-sense:5f -cagtcaggaccagcacat-3，)。PCR条件是:95°C, IOmin ；94°C, 30sec,60°C, 30sec, 72°C，lmin，共 35 个循环；72°C,IOmin0 PCR产物进行DNA凝胶电泳分析并拍照。PCR阳性的重组菌株，按照常规方法提取质粒，进行酶切鉴定，并且测序，对含有SEQ ID N0.1所示的优化pai基因的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的菌株(命名为重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80、PA1-91)继续下面的步骤 4 操作。
同时，按照上述方法将pNZ8149导入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900得到重组菌株作为空载体对照菌株(命名为重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149)。4、乳酸乳球菌诱导表达，脂肪酸含量测定分别从5毫升过夜培养的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900、重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149、PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80 和 PA1-91菌液中，取其中40微升接种到10毫升M17肉汤溶液中，30°C培养2_3小时，当0D_达到
0.4时，往菌液中同时添加诱导剂乳酸链球菌肽nisin (美国Sigma公司)和底物亚油酸(Sigma, L1012)，要求两种试剂的终浓度分别达到每毫升50纳克和0.5毫克，继续培养48小时，离心收集菌体，参照标准方法进行脂肪酸甲酯化处理，测定菌体中包括tl0cl2-CLA和亚油酸在内的各种脂肪酸的百分含量。具体步骤是:将菌体转移至带聚四氟乙烯瓶盖的玻璃甲基化管中，每份加4毫升氯乙酰甲醇(氯乙酰:甲醇=1:10)和2毫升正己烷，盖紧管盖，80°C水浴2小时，取出冷却至室温后，再加7%的K2CO3溶液5毫升，振荡混匀后静置10分钟，离心(IOOOrpm, 5min)分离的上清直接进样到HP-88型色谱柱(美国Agilent公司),使用HP7890全自动气相色谱仪(Agilent)进行分析，具体气相色谱程序是:初始温度120°C，保持Imin ;以10°C/min的速度升温至175°C，保持IOmin ;再以5°C/min的速度升温至210°C，保持5min ;再以5°C /min的速度升温至240°C，保持IOmin后结束。载气为氦气，分流比为10:1。采用外标法(标准曲线法)对脂肪酸进行定量。参照脂肪酸标准品(Sigma,47885-U和05632)的峰面积,将仪器检测到的信号,用GC ChemStation Software (Agilent)软件处理，计算相对含量，细胞培养和脂肪酸测定的实验连续重复4次，实验数据的显著性分析采用t检验。上述条件下，标准品中的tl0cl2-CLA、亚油酸保留时间分别为31.166分钟、28.239 分钟。重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91菌体中出现了保留时间分别为31.176分钟、31.180分钟、31.181分钟、31.182分钟、31.179分钟、31.175分钟的tl0cl2_CLA的层析峰；乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) NZ3900、重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149、PA1-22、PA 1-45, PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91菌体中出现了保留时间分别为28.241分钟、28.262分钟、28.261分钟、28.260分钟、28.281分钟、28.267分钟、28.265分钟、28.278分钟的亚油酸层析峰。结果表明乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900 (宿主菌)、重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) p8149 (空载体对照菌株)亚油酸的含量占菌体脂肪酸总量的64%左右，没有发生异构化过程，菌体内检测不到产物tl0cl2-CLA ;相反，转化PNZ8149-PAI质粒的所有菌株，包括重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91等菌株，都能够稳定表达pai基因，翻译的异构酶PAI可以有效的生产tl0cl2-CLA，产物tl0cl2-CLA的含量占菌体脂肪酸总量的15.19-23.91% (质量百分含量)。从图1也可以看出，不同菌株间，产物和底物的含量存在明显的不同(图1中，同一组分内，标注不同字母时，表示菌株间存在显著差异，即P〈0.05)。其中，重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75菌体中tl0cl2_CLA的含量最高，占菌体总脂肪酸含量的23.91%，显著优于重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)PA1-22、PA1-45、PA1-76、PAI_80、PA1-90等其它重组菌株(p〈0.05)，它的tl0cl2-CLA转 化效率(菌体中的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的质量与菌体中反式-10，顺式-12共轭亚油酸和亚油酸质量之和的比值)，即tl0cl2-CLA与(tl0cl2-CLA+LA)质量的比值，达到了 37.62%。这些结果说明，PAI重组乳酸菌能够有效的将亚油酸底物异构成tl0cl2-CLA产物，其中重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) PA1-75效果最好，为食品级的PAI重组乳酸菌的开发提供了依据和菌株。其中，重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75已于2013年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号=CGMCCN0 .7148。
权利要求
1.重组乳酸乳球菌，其特征在于:所述重组乳酸乳球菌是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) PA1-75，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7148。
2.构建重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤； 所述蛋白质PAI为如下a)或b)的蛋白质: a)由SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将SEQID N0.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a)衍生的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述蛋白质PAI的编码基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)其编码序列是SEQID N0.1的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质PAI的DNA分子； 3)与I)限定的DNA分 子具有90%以上的一致性且编码所述蛋白质PAI的DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述宿主菌为食品级乳酸乳球菌和/或其衍生菌； 所述蛋白质PAI的编码基因通过重组食品级表达载体导入所述宿主菌中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述食品级乳酸乳球菌为乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌，所述重组食品级表达载体为权利要求8或9所述的重组食品级表达载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7148。
7.由权利要求2-5中任一所述方法构建的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌。
8.表达权利要求2或3所述蛋白质PAI的编码基因的重组食品级表达载体。
9.根据权利要求8所述的重组食品级表达载体，其特征在于:所述重组食品级表达载体是将权利要求2或3所述蛋白质PAI的编码基因插入PNZ8149的多克隆位点得到的重组表达载体。
10.权利要求1所述的重组乳酸乳球菌或权利要求2-5中任一所述方法构建的重组乳酸乳球菌在生产反式-10，顺式-12共轭亚油酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。该构建重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤；所述蛋白质PAI为如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a)衍生的蛋白质。本发明的食品级重组乳酸乳球菌能够有效地生产t10c12-CLA，t10c12-CLA的含量占菌体脂肪酸总量的15.19-23.91%。
文档编号C12N15/74GK103146628SQ20131006610
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者苟克勉, 李世丽 申请人:苟克勉