一种高产酸的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体涉及一种高产酸的乳酸乳球菌乳酸亚 种菌株KLDS4001及其在制备切达干酪中的应用，本发明属于食品加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 干酪素有"乳制品之王"的美称，是世界乳制品贸易最大的乳制品之一。我国干酪 的需求量以每年15%的速度增长，而干酪工业化生产仅处于起步阶段，市场上干酪产品的 缺口仍然依靠进口商品来弥补，所以我国干酪工业化发展迫在眉睫。实现干酪的工业化生 产中，发酵剂至关重要。现今已涌现出一批具有专业化生产规模的知名发酵剂制造商，例如 丹麦Hasen公司和Danisco公司等，它们生产的乳品发酵剂性状稳定，形态各异，已成功地 应用于各种发酵乳制品的生产。目前国内生产干酪的直投式发酵剂完全来自进口，这严重 限制了我国干酪产业的发展。在我国，除西藏的曲拉等传统干酪产品外，国内的干酪生产刚 刚起步，生产中心主要停留在再制干酪加工和进口产品分装上（金越.国产干酪的研发现 状及展望[J].中国乳业，2010,4:104-106.)。对于干酪发酵剂的研宄人相对落后，存在的 突出问题是菌株的工业发酵性能差、活力低、细胞生物量收获少，菌体细胞浓度偏低，这些 因素制约着我国干酪发酵剂产业的发展。
[0003] 切达干酪是一种牛乳酶凝乳的酸性半硬质成熟干酪，是世界干酪生产的主要品种 之一，也是世界上购买与消费最多的一种奶酪。切达干酪的风味与其它许多干酪品种相比 较为温和，容易被中国消费者所接受。目前，开发可被中国消费者接受的风味淡香、口感适 宜的干酪，依旧是各大乳制品企业着力研宄的重点。
[0004] 干酪的成熟是指转变新鲜的凝乳成为具有一定质地、组织形态和形成干酪特有风 味的过程。其中涉及一系列微生物学、生物化学和化学反应，例如糖酵解、脂肪水解和蛋白 质水解。蛋白质水解是大部分干酪成熟过程中最主要，也是最复杂的生物化学反应，该反 应主要是由酶催化引起。这些酶主要来源于乳本身、凝乳酶、发酵剂微生物、辅助发酵剂微 生物以及外来非发酵剂微生物。由此可见，干酪内微生物在干酪成熟过程中起着至关重 要的作用，而作为微生物主要来源的发酵剂更成为国内外学者研宄的重点。Pappa(Pappa EC, Kandarakis I, Anifantakis EM, etal. Influence of types of milk and culture on the manufacturing practices, composition and sensory characteristics of Teleme cheese during ripening[J].Food control, 2006, 17:570-581.)用嗜热发酵剂、嗜温发酵 剂和嗜热-嗜温混合发酵剂制作干酪，研宄干酪在成熟期内理化性质变化，并对干酪的感 官进行评价。结果表明，3种发酵剂制作的干酪均有良好的品质，其中嗜温发酵剂和混合 发酵剂在产酸速率和感官鉴定中优于嗜热发酵剂。Rehman (Rehman SU, Drake MA, Farkye NY.Differences between Cheddar cheese manufactured by the milled-curd and stirred-curd methods using different commercial starters [J]. Journal of Dairy Science, 2008, 91 (I) : 76-84.)证实发酵剂类型比干酪的制作方法更能影响切达干酪风味 的形成。李丽（李丽，岳喜庆，张莉，等.发酵剂对双蛋白干酪理化特性及风味的影响[J]. 食品科学，2012, 33 ￠):15-18)得出：在干酪生产过程中添加豆乳及使用筛选的发酵剂，丰 富了干酪风味物质的种类，使干酪的风味和质地得到明显的改善。本发明将实验室筛选的2 株乳酸乳球菌作为复合发酵剂进行切达干酪的制备，旨在为开发适合我国消费者口味的干 酪产品提供理论依据。
[0005] 干酪的生产过程中，发酵剂发挥着重要的作用，即酸化、稳定结构和风味物质的形 成（Patrick FOX PhD DSC. Fundamentals of Cheese Science[M]. Aspen Publishers, Inc :Gaithersburg, Maryland, 2000:54-96.)。发酵剂在干酪生产中的主要作用是发酵乳糖产生 乳酸，选择产酸能力强的乳酸菌，一方面可加快预酸化速度；另一方面，pH的降低可提高排 除乳清的速率。有研宄表明，发酵剂菌株产酸缓慢，是导致干酪质量差的重要原因之一。凝 乳酶的凝乳速度与PH和专一性Ca 2+离子的浓度密切相关。通常情况下，鲜乳的pH是6. 7左 右，而凝乳酶的最适pH范围是5. 0?5. 5,低酸度环境还会增加 Ca2+离子的溶解度。因此， 在切达干酪的加工过程中，发酵剂的一个重要作用是产酸促进凝乳并且在干酪的后熟过程 中，低PH环境可有效抑制致病菌和腐败微生物的生长。乳酸乳球菌乳酸亚种是切达干酪生 产中常用的发酵剂菌株，我国拥有丰富的乳酸菌资源，可以筛选出高产酸能力的乳酸乳球 菌菌株，继而生产出高质量的切达干酪发酵剂，不但可以打破外国公司在该领域的垄断，还 可以发展具有自主知识产权的商品发酵剂，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效 益。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种适合切达干酪生产的高产酸的乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)KLDS4001〇
[0007] 本发明菌株KLDS4001是从乳品重点实验室保存的乳酸乳球菌分离筛选到的， 于2014年11月13号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保 藏号为CGMCC No. 9964,分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0008] 本发明以产酸能力和蛋白水解活性作为筛选指标，对乳品重点实验室保存的乳酸 乳球菌进行筛选，得到了一株产酸能力强、发酵性能优良的乳酸乳球菌乳酸亚种。该菌株在 脱脂乳中具有较强的产酸能力，发酵性能良好，可与乳酸乳球菌乳脂亚种复配作为切达干 酪发酵剂使用。
[0009] 本发明菌株KLDS4001的16SrDNA序列与目前发表的乳酸乳球菌乳酸亚种的 16SrDNA，同源性达到95%以上。综合形态特征与16SrDNA序列鉴定，菌株KLDS4001为乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) 〇
[0010] 本发明的另一个目的是提供所述的乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001在制备切达干 酪中的应用。
[0011] 进一步的，本发明提供了所述的乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001制备切达干酪的 方法，其特征在于，向原料乳中加入乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001和乳酸乳球菌乳脂亚种 混合制得的复合发酵剂，进行发酵，得到切达干酪。
[0012] 在本发明中，优选的，所述的复合发酵剂是乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001和乳酸 乳球菌乳脂亚种按照体积比1:1的比例混合制得。
[0013] 在本发明中，优选的，所述的复合发酵剂中乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001的活菌 数为 108-109cfu/mL。
[0014] 在本发明中，优选的，包括以下步骤：
[0015] (1)原料乳预处理：原料乳过滤后注入事先杀菌处理过的干酪槽中，63°C -68°C杀 菌 30min，冷却至 30°C -32°C ;
[0016] (2)复合发酵剂、氯化钙和凝乳酶的添加：将乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4001和 乳酸乳球菌乳脂亚种混合制得的复合发酵剂按照原料乳体积的1% -2%体积比的添加 量添加到原料乳中，31 °C控温发酵30?40min，直到牛乳酸度在0. 20 %?0. 22%，氯化 钙按照原料乳质量的0.01% -0.03%质量比的添加量，同时凝乳酶按照原料乳质量的 0. 002% -0. 005%质量比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀后，静置凝乳；
[0017] (3)切割、加温搅拌及排除乳清：凝乳酶添加后，待凝乳充分形成，即可进行凝块 切割，当乳清酸度达到0. 2%时，排除一半乳清；
[0018] (4)切达化：凝块在乳清中融合，去除剩余乳清，切割成凝块，并上下叠放，每间隔 15min进行一次翻转放置，直到pH达到5. 3?5. 4 ;
[0019] (5)凝块破碎和盐渍：将凝块切成1. 5?2. Ocm的方块后采用干法盐渍，添加量按 干酪重量的2. 2% -2. 7%的添加量分三次添加食盐，间隔时间5min，并不断搅拌；
[0020] (6)压榨成型、包装及成熟：将盐渍后的干酪块