专利名称：一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法
技术领域：
本发明属于生物质资源化与生物能源领域，特别涉及一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法。
背景技术：
随着石化资源的日益紧缺，能源问题开始备受关注，开发生物质资源获取生物能源也成为了研究热点。利用植物或动物来源生产生物能源可能会导致世界粮食供应问题，寻找更为理想的生物能源来源成为了技术发展的瓶颈。小球藻是ー类重要的高产油高蛋白微藻，其产油率高，富含蛋白质、脂质、多糖、食用纤维及微量元素，可直接处理工业废气达到减排效应，具有竞争生长优势，可高附加值利用，生长不占用耕地等，被认为具有极高的 应用价值(张薇，吴虹，宗敏华.蛋白核小球藻发酵产油脂的研究.微生物学通报，2008，35(6) :855-860)。近年来，利用生物源活性物质调控微藻生长得到较快发展。已有利用植物代谢物质纯品或人工合成的调节剂来促进微藻的生长，如赤霉素等(孟春晓，高政权.外源赤霉素对雨生红球藻中虾青素积累的影响.水产科学，2007. 26(5) :249-255)。落叶乔木毛白杨是ー种优良造林速生树种，也是常见的行道树绿化树种，分布广泛，资源丰富，毎年产生大量的落叶。毛白杨落叶目前一般多被收集填埋或堆肥用，利用途径有限且附加值不闻。
发明内容
本发明的目的是开发一种促进小球藻快速生长的毛白杨落叶活性物质的制备技术，以期实现对高价值小球藻的快速高效培养和大量毛白杨落叶生物量的高附加值利用。本发明基于大量实验研究，发现毛白杨落叶中存在可显著促进小球藻快速生长的活性物质。为了获取毛白杨落叶中的高效促藻物质，本发明开发了ー种毛白杨落叶活性物质的制备方法。该方法其特征在于包括以下步骤I)采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至40目-100目，将处理好的毛白杨落叶粉末贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。2)称取一定量毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中。3)毛白杨落叶粉末的水浸提方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I 20-1 5，辅助磁力搅拌器搅拌，常温浸泡36 54h。4)毛白杨落叶粉末的水煮沸方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I 20-1 5，40°C-60°C温水浸泡O. 5-lh后，再经电炉煎煮4-6h。5)毛白杨落叶粉末的硫酸酸化方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I : 20-1 5，加入适量硫酸使混合物pH值为2-3或4-5，分别置于常温25°C处理2d，中温60°C处理12h，高温100°C处理lh，处理后混合物用氨水中和至pH值为7. O。6)上述各种制备方式得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌即得到毛白杨落叶制备液。7)在无菌条件下，控制小球藻藻液中毛白杨落叶制备液浓度为5g/L_20g/L，每天定时摇动3-5次，培养5-7d。其中促进效果最佳的制备方法为蒸馏水煮沸，促进效果最弱的方法为硫酸PH2-3酸化处理12h。8)小球藻培养条件为温度25°C，光照lOOOlux，光暗时间比为14h 10h，培养基
为无菌SE培养基。在步骤I)中的毛白杨落叶清理的方式通过旋振筛，筛分毛白杨落叶上吸附的尘土及颗粒；后经自来水快速冲淋，去离子水洗涤后60°C烘干处理2d，即得到毛白杨干燥落叶。在步骤5)中所述硫酸酸液摩尔浓度控制在15-18M之间。 在步骤5)中所述氨水摩尔浓度控制在12-15M之间。在步骤5)中所述硫酸酸化处理方法也是毛白杨落叶纤维素和半纤维素利用的一种前处理方法，处理产物亦具有较明显的促藻效果，エ艺上结合可达到落叶生物量高效利用的目的。本发明所述从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法具有过程简单，来源广泛，费用低，制备效果好等优点，可在小球藻快速培养和毛白杨落叶高效利用方面应用。
图I是毛白杨落叶制备液对小球藻生长的促进效果图。
具体实施例方式下面以实施例进ー步说明本专利。实施例I 采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，用250mL蒸馏水，在磁力搅拌器搅拌下，常温浸泡48h。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22μπι滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到13. 82倍；投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到
20.61倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到24. 45倍。实施例2采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，用250mL40°C蒸馏水浸泡0. 5h后，再经电炉煎煮4h。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经0. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到10. 16倍；投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到
21.14倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到27. 66倍。实施例3采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取12. 5g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调pH值至2-3，置于高温100°C处理lh，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到I. 49倍；投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到3. 54倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到5. 48倍。实施例4采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取25g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调PH值至2-3，置于中温60°C处理12h，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到20% ;投加浓度为 10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到8%;投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到31%。实施例5采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调PH值至2-3，置于常温25°C处理2d，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到3. 15倍；投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到3. 20倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到2. 10倍。实施例6 采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调pH值至4-5，置于高温100°C处理lh，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到5. 10倍；投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到4. 41倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到6. 08倍。实施例7采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调pH值至4-5，置于中温60°C处理12h，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到45% ;投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到76% ;投加浓度为20g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到I. 66倍。实施例8
采集Ikg毛白杨落叶，清理干净后经粉碎机粉碎至50目并贮存于密封棕色干燥玻璃容器中。称取50g毛白杨落叶粉末置于500mL玻璃缸中，加入250mL蒸馏水。后加入硫酸调PH值至4-5，置于常温25°C处理2d，后用氨水中和至pH值为7. O。得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O. 22 μ m滤膜过滤去除杂菌，即得到毛白杨落叶制备液。与空白对照相比，投加浓度为5g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到70% ;投加浓度为10g/L时，第7天对小球藻的生长促进率可达到I. 71倍；投加浓度为20g/L时，第7天对小 球藻的生长促进率可达到2. 11倍。
权利要求
1.一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，其特征在于按如下步骤进行 1)将采集到的毛白杨落叶清理干净并粉碎至40 100目； 2)毛白杨落叶粉末后置于玻璃缸内，分别采用蒸馏水浸提、蒸馏水煮沸、硫酸酸化pH值2-3处理lh、硫酸酸化pH值2-3处理12h、硫酸酸化pH值2_3处理2d、硫酸酸化pH值4-5处理lh、硫酸酸化pH值4-5处理12h、硫酸酸化pH值4_5处理2d得到提取物； 3)上述制备方式得到的提取物，经减压抽滤滤除颗粒物后，再经O.22 μ m滤膜过滤去除杂菌即得到毛白杨落叶制备液。
2.按照权利要求I所述的一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，其特征在于，所述步骤2)中的蒸馏水浸提采用下述方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I : 20-1 5，辅助磁力搅拌器搅拌，常温浸泡36 54h。
3.根据权利要求I所述的一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，其特征在于在步骤2)所述的蒸馏水煮沸采用下述方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I : 20-1 5，40°C-60°C温水浸泡O. 5-lh后，再经电炉煎煮4h。
4.根据权利要求I所述的一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，其特征在于步骤2)中所述的硫酸酸化采用下述方法落叶粉末与蒸馏水(质量体积比，g/mL)控制在I : 20-1 5，加入适量硫酸使混合物pH值为2-3或4-5，分别置于常温25°C处理2d，中温60°C处理12h，高温100°C处理lh，处理后混合物用氨水中和至pH值为.7.O。
5.权利要求I所述的一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，在进行小球藻快速培养和毛白杨落叶高效利用方面的应用。
全文摘要
一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，属于生物质资源化与生物能源领域。为了解决新型生物质能源藻小球藻的快速生长问题，寻找可促进其生长的物质，本发明公开了一种从毛白杨落叶中获取促进小球藻快速生长制备液的方法，包括如下步骤采集毛白杨落叶，清理落叶并粉碎至40目～100目；称取落叶粉末于玻璃缸中，后用蒸馏水常温浸提、蒸馏水煮沸提取、硫酸酸化pH值2-3处理(1h、12h或2d)或硫酸酸化pH值4-5处理(1h、12h或2d)得到提取物；提取物经过滤去除颗粒，即可获得毛白杨落叶的制备液。各制备液均可显著促进小球藻生长，其中经蒸馏水煮沸得到的制备液促藻效果最佳。本发明促藻效果显著，既消除了落叶废弃物对环境的污染又充分利用了其中的高价值物质，并为工业化快速培养小球藻提供了可能。
文档编号C12N1/22GK102839146SQ201210358609
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者洪喻, 上官小亚, 秦墨梅 申请人:北京林业大学