专利名称：一种蝇类肠道微生物总dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学实验室技木，尤其是一种经过改进的蝇类肠道微生物总DNA的提取方法。
背景技术：
蝇类是ー种与人类生活关系密切的昆虫，由于独特的生活习性，其与许多动物和人类疾病的传播有夫，已被世界卫生组织确定为媒介生物。蝇类由于长期生活在卫生条件恶劣的地区，其体内存在独特的微生物群落，这些微生物群落不仅在蝇类的营养发育中发挥重要作用，而且其中大量的致病菌还不断激发蝇类的自然免疫系统，产生抑菌肽。因此对蝇类肠道微生物群落的研究不仅能发现新的微生物种类、掲示疾病传播的规律，还能研究致病菌与动物自然免疫系统之间的协同进化关系，研究和分离天然抑菌肽。
传统方法在研究自然环境中的微生物时，首先需要对微生物进行纯化培养，不仅费时费力，而且目前的实验技术只能对自然界中约1%的微生物进行纯化培养，剰余99%的微生物由于不能在实验室培养，研究比较困难。现代分子生物学技术的发展，PCR技术、基因组测序和宏基因组方法的推广应用，为研究自然界微生物群落结构提供了有利工具。采用分子生物学方法研究环境微生物群落，首先需要从环境样本中提取到微生物的总DNA，环境样本种类繁多、成分复杂、干扰物质可能对下游操作产生影响。因此，建立高效、快速的微生物总DNA提取方法是进行环境样本微生物群落研究的前提。蝇类肠道微生物总DNA提取的主要目标是获得高质量的总DNA，确保DNA的完整性和代表性，以利于进ー步建立有代表性的16S rRNA文库。但来自蝇类肠道的样品成分非常复杂，尤其是脂类、酸类等有机物质在总DNA提取过程中很难去除，直接影响后续的PCR扩增、酶切反应的效果。此外，微量的蝇类肠道样本，经过细胞裂解、DNA纯化等多个步骤以后，得率大大降低，最終得到的总DNA浓度往往不能满足下一歩分子操作的需要。目前大部分总DNA提取方法都存在缺陷，如细胞裂解不完全、DNA提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切等问题。因此为了解决常规方法获得的DNA样品存在酶反应抑制物、细胞裂解率低、DNA损失严重等问题，需要研究适用于蝇类肠道微生物总DNA提取的方法。
发明内容
本发明的目的是提供ー种适用于蝇类肠道微生物总DNA提取的方法，以克服常规方法获得DNA样品存在酶反应抑制物、细胞裂解率低、DNA损失严重方面的缺陷。本发明之目的是通过以下技术方案来实现的ー种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤
(1)在一个灭菌的3cm培养皿中加入ImLSTE缓冲液，取出蝇类的中肠，在STE中悬浮，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；
(2)将由上述步骤(I)获得的中肠悬浮液转移到一个无菌I.5mL离心管中，涡旋震荡lmin,200rmp离心2min,将获得的上层液体转移到ー个新的无菌1.5mL第二离心管中；
(3)再在原有的无菌I.5mL离心管的沉淀中加入O. 5mLSTE缓冲液，2 3次重复步骤
(2)，并将离心后获得的上层液体合并；
(4)将上述步骤(3)中合并的上层液体置于新的无菌I.5mL第三离心管中，5000 8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用20(^LSTE缓冲液将第三离心管底的沉淀重悬；
(5)将上述步骤(4)中获得的沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37°C温度培育Ihr ；
(6)再加入20μ 10%的SDS和WL 50mg/mL蛋白酶K，充分混匀，55°C温度培育18 24hr ；
(7)再加入2.5μ 10mg/mL RNA酶A，充分混匀，37°C温度培育Ih ;
(8)再加入等体积的配比比例为24:1的氯仿异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min ;将上清液转入ー个新的第四离心管中；
(9)将上述步骤(8)中获得的上清液加入等体积的配比比例为25:24:1的酚氯仿异戍醇(25:24:1),充分抽提，12000rmp离心5min,获取上清液转入新的第五离心管中；
(10)将上述步骤(9)中获得的上清液加入O.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%こ醇离心洗涤2次；
(11)将上述步骤(10)中获得的沉淀物，在室温下充分干燥后，用50μ 的TE缓冲液溶解沉淀物，获得DNA分子；
其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/LEDTA, 150 mmol/L NaCl 组成；
TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8· 0)，I mmol/L EDTA (pH 8. 0)组成。上述实验步骤中，所用试剂全部为国产试剂，包括包括酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、1^8、!1(^0丁六、恥(1、溶菌酶、蛋白酶1(、1 應酶。其中，氯仿异戊醇(24:1)、酚氯仿异戊醇(25:24:1)是体积比，试剂为分析纯试剂。关于“在室温下充分干燥后” 一般而言指的是在空气中自然干燥30min左右。与常规方法比较，本发明的优点与显著效果表现在
I、本发明采用物理、化学、酶法相结合的方法提取蝇类肠道微生物总DNA，方法适合于微量样本中微生物总DNA的提取，获得的DNA分子纯度高，对下一歩分子生物学操作干扰少，有利于建立16S rRNA基因文库。2、本发明所述的DNA提取方法操作步骤简单，可以有效降低操作过程对样品的污染和对DNA分子的破坏。3、本发明中使用的设备和试剂均为实验室常规设备和常用试剂，其成本远低于进ロ及国产试剂盒。
图I是本发明所述家蝇肠道总DNA 16SrRNA PCR电泳图。图2是本发明具体实施实例中总DNA 16SrRNA PCR电泳图。图I中需要说明的是1、进ロ DNA提取试剂盒提取的总DNA PCR电泳图；2、国产DNA提取试剂盒提取的总DNA PCR电泳图；3、本发明方法提取的总DNA PCR电泳图。图2中需要说明的是M、表示分子量标记；I、家蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR电泳图；2、大头金蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR电泳图；3、巨尾阿丽蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR 电泳图。
具体实施例方式以下结合附图及实例进ー步详细描述本发明的技术方案。需要指出的是此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。參见图I、图2。图I说明，使用本方法提取的总DNA进行下ー步PCR反应，PCR扩增的效果比进口和国产试剂盒好，例如条带集中而且明亮；图2说明本方法在三种蝇类中使用效果是一致的，说明了方法的稳定性和适用性。实例I
(1)在一个灭菌的3cm培养皿中加入ImLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只家蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；
(2)将中肠悬浮液转移到一个无菌I.5mL离心管中，润旋震荡lmin,200rmp离心2min, 将上层液体转移到ー个新的无菌I. 5ml第二离心管中；
(3)在原有的无菌I.5mL离心管中加入O. 5mLSTE缓冲液重复步骤2，2 3次，合并上层菌液；
(4)将合并的上层菌液菌液置于无菌I.5mL第三离心管中，5000 8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用20(^LSTE缓冲液重悬沉淀；
(5)在沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37°C温度培育Ihr ；
(6)加入20μ 10%的SDS和50mg/mL蛋白酶K Ιμ ,充分混匀，55°C温育18 24hr ；
(7)加入10mg/mLRNA酶A 2· 5μ ,充分混匀，37°C温度培育Ih ；
(8)加入等体积的的氯仿异戍醇(24:1),充分混勻，12000rmp离心5min;将上清液转入一个新的第四离心管中；
(9)加入等体积的的酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1),充分抽提，12000rmp离心5min,将上清液转入新的第五离心管中；
(10)加入O.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%こ醇离心洗涤2次；
(11)室温充分干燥后，用50μ 的TE缓冲液溶解沉淀的DNA分子。实例2
(1)在一个灭菌的3cm培养皿中加入ImLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只大头金蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；
(2)将中肠悬浮液转移到一个无菌I.5mL离心管中，润旋震荡lmin,200rmp离心2min,将上层液体转移到ー个新的无菌I. 5ml第二离心管中；
(3)再在原有无菌I.5mL离心管中加入O. 5mLSTE缓冲液重复步骤2，2 3次，合并上层菌液；
(4)将合并的上层菌液置于新的无菌I.5ml第三离心管中，5000 8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用20(^LSTE缓冲液重悬沉淀；
(5)在沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37°C温度培育Ihr ；
(6)加入20μ 10%的SDS和50mg/mL蛋白酶K μ ,充分混匀，55 °C温度培育18 24hr ；
(7)加入10mg/mLRNA酶A 2. 5μ ，充分混匀，37°C温度培育Ih ；
(8)加入等体积的的氯仿异戍醇(24:1),充分混勻，12000rmp离心5min。将上清液转入ー个新的第四离心管中； (9)加入等体积的的酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1),充分抽提，12000rmp离心5min,将上清液转入新的第五离心管中；
(10)加入O.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成。12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%こ醇离心洗涤2次；
(11)室温充分干燥后，用50μ 的TE缓冲液溶解沉淀的DNA分子。实例3
(1)在一个灭菌的3cm培养皿中加入ImLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只巨尾阿丽蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；
(2)将中肠悬浮液转移到一个无菌I.5mL离心管中，润旋震荡lmin,200rmp离心2min,将上层液体转移到ー个新的无菌I. 5ml第二离心管中；
(3)再在原有无菌I.5mL离心管中加入O. 5mLSTE缓冲液重复步骤2，2 3次，合并上层菌液；
(4)将合并的上层菌液置于新的无菌I.5ml第三离心管中，5000 8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用20(^LSTE缓冲液重悬沉淀；
(5)在沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37°C温度培育Ihr ；
(6)加入20μ 10%的SDS和50mg/mL蛋白酶K μ ,充分混匀，55 °C温度培育18 24hr ；
(7)加入10mg/mLRNA酶A 2. 5μ ，充分混匀，37°C温度培育Ih;
(8)加入等体积的的氯仿异戍醇(24:1),充分混勻，12000rmp离心5min,将上清液转入一个新的第四离心管中；
(9)加入等体积的的酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1),充分抽提，12000rmp离心5min,将上清液转入新的第五离心管中；
(10)加入O.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%こ醇离心洗涤2次；
(11)室温充分干燥后，用50μ 的TE缓冲液溶解沉淀的DNA分子。其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl 组成；TE缓冲液由 10 mmol/T, Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)组成，两种均需要在实验室预先配置而成。
权利要求
1.一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)在一个灭菌的3cm培养皿中加入ImLSTE缓冲液，取出蝇类的中肠，在STE缓冲液中悬浮，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎； (2)将由上述步骤(I)获得的中肠悬浮液转移到一个无菌I.5mL离心管中，涡旋震荡lmin,200rmp离心2min,将获得的上层液体转移到一个新的无菌I. 5mL第二离心管中； (3)再在原有的无菌I.5mL离心管的沉淀中加入0. 5mLSTE缓冲液，2 3次重复步骤(2)，并将离心后获得的上层液体合并； (4)将上述步骤(3)中合并的上层液体置于无菌I.5mL第三离心管，5000 8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200MLSTE缓冲液将第三离心管底的沉淀重悬； (5)将上述步骤(4)中获得的沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37°C温度培育Ihr ； (6)再加入20ML10%的SDS和IML 50mg/mL蛋白酶K，充分混匀，55°C温度培育18 24hr ； (7)再加入2.5虬10mg/mL RNA酶A，充分混匀，37°C温度培育Ih ; (8)再加入等体积的的配比比例为24:1的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000 离心5min ;将上清液转入一个新的第四离心管中； (9)将上述步骤(8)中获得的上清液加入等体积的配比比例为25:24:1的酚氯仿异戍醇(25:24:1),充分抽提，12000rmp离心5min,获取上清液转入新的第五离心管中； (10)将上述步骤(9)中获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%乙醇离心洗涤2次； (11)将上述步骤(10)中获得的沉淀物，在室温下充分干燥后，用50ML的TE缓冲液溶解沉淀物，获得DNA分子； 其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/LEDTA, 150 mmol/L NaCl 组成； TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，I mmol/L EDTA (pH 8. 0)组成。
全文摘要
一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，涉及分子生物学实验技术领域。酚氯仿方法是提取细菌DNA的传统方法，但该方法一般用于实验室纯培养细菌的DNA提取。而环境样本由于基质成份和微生物种类都比较复杂，用酚氯仿方法和试剂盒方法提取总DNA，存在细胞裂解率低、DNA损失严重等缺陷，而且提取物中残留的酶抑制物会影响后续PCR扩增和酶反应效果。对此，本发明在样品前处理、操作步骤、试剂溶液等方面进行了改进；本发明采用STE缓冲液对样品进行前处理；使用溶菌酶使革兰氏阳性球菌充分裂解。本发明提取的蝇类肠道微生物总DNA，用于PCR扩增和16SrRNA文库构建，效果优于国产和进口试剂盒。其操作步骤简单，有效降低了操作过程对样品的污染和对DNA分子的破坏。
文档编号C12N15/10GK102827833SQ20121035780
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者刘杨, 樊学军, 杨雨, 钟玮, 田绿波, 赵锋 申请人:四川国际旅行卫生保健中心